신경교세포 특성화

성상교세포, 미세아교세포, 희돌기아교세포와 같은 신경교세포는 항상성 유지, 시냅스 형성에 적극적으로 관여하거나 뉴런을 보호하고 지원하는 등 중추신경계(CNS)에서 여러 가지 중요한 역할을 합니다. 최근 건강과 질병에서 신경교세포의 역할에 대한 이해가 중요해지면서 신경교세포 중심의 관점에서 새로운 연구 도구와 접근법이 개발되고 있습니다. 이제 신경교세포 배양은 기초 및 중개 연구에 중요한 도구로 인식되고 있으며, 일차 배양 또는 iPSC의 사용이 인간 질병을 연구하는 데 더 적합하다고 여겨지고 있습니다. 그러나 모델은 대부분 종말점 형태학적 및 면역조직화학적 방법으로 제한되어 있습니다. 신경교세포 연구는 신경교세포의 성장, 형태, 기능, 궁극적으로 CNS 질환에서의 역할에 대한 통찰력을 높이기 위한 기술 도구와 중개적 체외 모델 개발의 혜택을 받을 수 있습니다.

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백서: 라이브 세포 분석으로 성상교세포 모델 특성화하기

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운동학적이고 처리량이 많은 측정을 사용하여 다양한 뇌 영역의 동적 생물학적 모니터링

그림 1. 뇌 영역 성상아교세포를 시간적으로 모니터링한 결과 세포 성장과 형태에 차이가 있는 것으로 나타났습니다. 피질, 해마 및 소뇌 성상교세포를 96웰 플레이트에 2,000세포/웰로 시딩했습니다. 10일 동안 증식 및 형태를 모니터링했습니다. 이미지는 30-40% 합류 시점(2일, 피질 또는 4일, 해마 및 소뇌)에서 배양된 배양물을 보여주며, 형태학적 표현형이 정량화되어 있습니다(분홍색 및 갈색 마스크). 시간 경과 프로필은 뇌 영역 간의 성장을 비교하여 피질 성상교세포의 성장 속도가 가장 빠르다는 것을 보여줍니다. 소뇌 성상교세포가 96시간(68.3 ± 1.8)까지 가장 높은 파급력을 보인 후 해마(50.6 ± 1.5), 피질(12.3 ± 0.7) 순으로 신경교세포의 파급력을 시간 경과에 따라 비교한 결과입니다. 각 웰에 대한 최대 파급 효과도 표시됩니다(변동성 플롯). 데이터는 평균 ± SEM(24개 복제본)으로 표시되며 이미지는 10배율로 캡처되었습니다.

소뇌 성상세포에 대한 이오노마이신의 약리학적 효과

그림 2. 이오노마이신으로 인한 칼슘 증가는 소뇌 성상세포의 세포 성장과 건강에 영향을 미칩니다. 소뇌 성상교세포를 96웰 플레이트에 10,000세포/웰로 시딩하고 세포 건강 시약인 Incucyte^® 아넥신 V NIR(싸토리우스; 0.5%)이 보충된 배지에서 칼슘 이온성 이오노마이신(0.01 - 10 µM)으로 처리했습니다. 10일 동안 증식 및 세포 건강을 모니터링했습니다. 시간 코스는 세포 성장에 대한 이오노마이신의 동역학적 효과를 보여줍니다. 농도반응곡선은 이오노마이신이 세포 성장과 건강에 미치는 영향을 비교한 것으로, 농도에 따른 세포융합의 감소와 세포자멸사의 증가가 관찰되어 이오노마이신의 독성 효과를 시사합니다. 대표 이미지는 24시간 동안의 성장(위상) 및 세포 건강(NIR)에 미치는 영향을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM(3개 복제본)으로 표시되며 이미지는 10배율로 캡처되었습니다.

복잡한 변조를 풀기 위해 비교란 시약을 사용하여 세포 주기 진행, 변조 및 세포 생존력을 모니터링합니다.

그림 3. 오카다산(OKA)에 의한 세포주기 정지는 성상세포 세포주에서 세포자멸사와 구별할 수 있습니다. Incucyte^® 셀 사이클 그린|오렌지 렌티바이러스를 발현하는 T98G 성상세포를 96웰 플레이트에 4,000세포/웰로 시딩했습니다. 세포를 단백질 포스파타제 억제제 OKA(50 - 0.14 nM)로 처리하고 세포 건강 시약 Incucyte^® 아넥신 V NIR(0.5%; 싸토리우스)을 사용하여 세포주기 정지 및 세포 생존율에 미치는 영향을 확인했습니다. 세포를 개별적으로 세분화할 수 있도록 Incucyte^® Cell-by-Cell 분석 모듈을 사용하여 10배율로 이미지를 획득했으며, 처리 후 2일 동안 매개체 및 OKA에 대한 대표적인 위상 및/또는 형광(녹색, 오렌지, NIR) 단계 비디오를 표시했습니다. S|G2|M(녹색) 또는 G1(주황색)의 세포 개체군과 매개체 또는 OKA에 대한 아넥신 V 양성 세포 개체군(청록색)을 보여주는 시간 경과를 보면 OKA(5.56 nM)는 16시간 이내에 S|G2|M에서 세포 사멸을 유발했고 이는 세포 사멸 세포 수가 증가하기 시작하는 약 36시간까지 안정적으로 유지되었습니다. 농도반응곡선은 20시간에 다른 단계의 집단에 대한 OKA의 빠른 효능과 48시간에 세포 생존력(아넥신 V 양성)에 대한 지연된 효과를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SEM, 6회 반복으로 표시됩니다.

완전 자동화된 분석으로 실시간 세포 이동 측정을 수행하여 부상 후를 실시간으로 평가합니다.

그림 4. 손상 후 다양한 뇌 영역의 성상교세포의 이동 및 약리학적 억제. 원시(피질, 해마, 소뇌) 또는 iPSC(CDI, 후지필름) 성상교세포를 30,000세포/웰의 Incucyte^® ImagelockT96-웰 플레이트에 시드하고 Incucyte^® Woundmaker로 정밀하고 재현 가능한 상처를 생성했습니다. 이미지는 Incucyte^® 생세포 분석 시스템을 사용하여 획득했습니다. 위상 비디오는 3일 동안 손상 후 해마 배양의 이동을 보여주며, 초기 스크래치 상처(파란색 마스크)와 봉합 중 상처(밝은 노란색 마스크)를 분할하여 세포의 형태학적 평가를 가능하게 합니다. 시간 경과 프로파일은 다양한 뇌 영역의 상처 폐쇄 속도를 비교하며 소뇌 성상교세포가 가장 빠르게 이동합니다. 약리학 연구를 위해 상처를 입히기 전에 피질 성상교세포를 이오노마이신(10 - 0.01 µM)으로 배양한 결과, 농도 의존적인 이동 억제가 관찰되었습니다(IC50 = 1.67 µM). 데이터는 평균 ± SEM, 24개 복제본으로 표시됩니다.

완전 자동화된 분석을 통해 실시간으로 신경교세포의 화학적 축성을 정량화합니다.

그림 5. FBS를 향한 T98G-WT 성상세포 화학주성 이동. T98G-WT 세포를 1,000세포/웰의 밀도로 PDL(0.1mg/mL)로 코팅된 Incuycte^® ClearView 96-Well 케모택시스 플레이트의 상단 챔버에 플레이트 처리했습니다. 세포가 부착되면 화학 유인제로서 태아세포 혈청(FBS; 10 - 0.12%)을 바닥 챔버에 첨가했습니다. 이미지와 각 마스크는 추가 후 48시간 시점에서 멤브레인의 상단과 하단을 나타냅니다. 48시간의 시간 경과 및 막대 차트는 FBS 수준이 증가함에 따라 기공을 통한 화학적 이동의 농도 의존적 증가를 나타냅니다(EC50 = 3%). 데이터는 평균 ± SEM, 10회 반복으로 표시됩니다.

성상교세포 지원 기능을 평가하기 위해 관련 세포 모델, iPSC 유래 또는 일차 세포를 단독 또는 공동 배양하여 성상교세포 지원 기능을 연구합니다.

그림 6: 신경세포 공동 배양에서 iPSC 성상세포는 뉴라이트 발달을 향상시키고 네트워크 활동을 안정화시킵니다. 인간 iPSC 유래 뉴런을 성상세포와 단독 또는 공동 배양(뉴런의 경우 25K, 성상세포의 경우 10K 세포/웰; Talisman Therapeutics)으로 시딩했습니다. 뉴런은 각각 뉴라이트 발달을 평가하거나 시간에 따른 자발적인 뉴런 활동을 모니터링하기 위해 Incucyte^® 뉴로라이트 또는 뉴로버스트 오렌지(싸토리우스)로 감염시켰습니다. 시간 경과에 따라 공동 배양은 단일 배양에 비해 더 큰 뉴라이트 분지와 성장을 보였습니다(228시간에서 각각 147 ± 2.5 대 72 ± 2.5 mm/mm2, NL). 트레이스는 시야 내에 있는 모든 활성 개체의 칼슘 변동을 나타냅니다. 막대 그래프는 활성 물체의 정량화, 상관관계(연결성), 버스트 속도 및 지속 시간을 23일에 보여줍니다. 공동 배양은 단일 배양에 비해 활성 개체가 증가하고 오래 지속되는 칼슘 이벤트의 빈도가 감소하여 네트워크 안정화를 나타내며, 연결성은 영향을 받지 않습니다. 결과는 공동 배양에서 뉴런이 향상된 형태학적 표현형을 나타내고 기능적으로 더 성숙한 네트워크를 개발하는 iPSC 성상교세포의 지원 기능을 시사합니다. 평균 ± SEM, 24개 복제본.

주문 정보

제품	수량	Cat. No.
Incucyte^® 화학축 분석 소프트웨어 모듈	각	9600-001
Incucyte^® 클리어뷰 96-웰 케모택시 플레이트	각	4582
Incucyte^® 스크래치 상처, 세포 마이그레이션 소프트웨어 모듈	각	9600-0012
Incucyte^® 스크래치 상처, 세포 이동 키트	각	4493
Incucyte^® 스크래치 상처 세포 침입 액세서리	각	4444
Incucyte^® 이미지락 96웰 플레이트	각	4444
Incucyte^® Cell Cycle Red/Green Lentivirus Reagent	1 vial (0.2 mL)	4779
Incucyte^® Cell Cycle Green/Orange Lentivirus Reagent	1 vial (0.2 mL)1 vial (0.2 mL)	4809
Incucyte^® Cell-by-Cell Analysis Software Module	1 Module	9600-0031