고성능 유세포분석을 사용한 단일클론항체 결합 분석 

그림 1a. iQue^® 고성능 유세포분석 플랫폼으로 살아있는 세포와 mAb의 결합을 간단히 분석

그림 1b. iQue^® 경쟁적 결합 분석 과정

형광단과 결합된 2차 항체로 경쟁 항체를 튜브 안에서 미리 라벨링한 다음, 분석 플레이트에서 원하는 무표지 테스트 항체와 혼합합니다. 그리고 항체 혼합물에 표적 세포를 첨가하면 라벨링된 경쟁 mAb와 테스트 mAb가 동일한 에피토프를 표적으로 하는 경우 표적 항원과의 결합을 위해 서로 경쟁합니다. 따라서 테스트 항원의 농도가 높을수록 라벨링된 경쟁 항체의 결합이 덜 발생하게 되고, 2차 항체 형광단의 MFI 값이 낮아집니다. 두 항체가 같은 에피토프를 두고 경쟁하지 않으면 MFI는 테스트 mAb 농도에 의해 영향을 받지 않습니다. 

데이터를 보다 빠르게 수집하고 분석하므로 신속한 결정이 가능합니다.

그림 2. 새로운 데이터 시각화 기능이 탑재된 iQue^® Forecyt 소프트웨어를 사용한 항CD20 바이오시밀러의 결합 비교

직접 mAb 결합 분석을 사용해 항CD20 mAb 리툭시맙, 그리고 바이오시밀러 중 하나인 트룩시마와 CD20 고발현 Raji 세포와의 결합을 측정했습니다. (A) 살아있는 세포 가운데 관문 문턱값 이상으로 항체 결합에 양성을 나타내는 세포의 비율을 보여주는 히트 맵입니다. (B) 2차 항체의 MFI와 함께 리툭시맙과 트룩시마 농도가 증가하지만 IgG 대조군에 따라 변화하지는 않음을 보여주는 히스토그램입니다. (C) 관문 문턱값 이상으로 mAb 결합에 양성을 나타내는 세포의 비율을 보여주는 농도반응곡선입니다. (D) iQue^® Forecyt 상세 정보에서 직접 추출한 값을 정리한 표로, (C)의 곡선에서 나타난 특성과 일치합니다. 

세포 표면과의 결합을 위한 항체 라이브러리 스크리닝 시간을 최소화해 항체 발견 과정의 처리량을 높여줍니다.

그림 3. 항체 스크리닝에서 경쟁적 결합 분석 포맷을 사용해 파악한 에피토프 결합의 차이

RPE와 결합된 2차 항체를 사용해 3개의 항HER2 치료용 mAb(트라스투주맙, 카드실라, 페르투주맙)을 1:1 비율(1.5µg/mL)로 라벨링한 다음, 384웰 플레이트로 옮기고 iQue^® 세포막 완전성(R/Red) 염료 및 다양한 농도의 무표지 mAb를 첨가했습니다. 이어서 HER2 발현 AU565 세포를 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에서 45분간 배양한 뒤 iQue^® 플랫폼으로 데이터를 수집했습니다. 

히트 맵을 보면 살아있는 세포와 결합한 2차 항체의 중위형광강도(MFI)를 확인할 수 있습니다(어두운 회색 = MFI 높음, 밝은 회색 = MFI 낮음). 또한, 데이터를 통해 트라스투주맙과 카드실라(트라스투주맙 기반 ADC)가 동일한 HER2 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고 있음을 알 수 있습니다. 페르투주맙은 다른 HER2 에피토프와 결합했기 때문에 다른 mAb와 경쟁하지 않았습니다. 트라스투주맙을 가열하는 경우, 다른 mAb와의 경쟁이 가열하지 않은 mAb와 비교해 소폭 감소했습니다.
 

부유세포나 부착세포 모델에서 여러 치료용 항체를 특성분석할 수 있습니다.

그림 4. 부유세포와 부착세포의 표적 항원에 대한 항체 결합의 특이도 평가

부유성 및 부착성 암세포주 모델을 사용해 두 치료용 항체(리툭시맙, 트라스투주맙)의 결합과 특이도를 평가했습니다. 항원에 음성인 Jurkat 및 MDA-MB-468 세포와 구별할 수 있도록 CD20 양성 Ramos 세포와 HER2 양성 AU565 세포를 iQue^® 세포 확산 및 라벨링 염료(V/Blue)로 라벨링했습니다. 

RPE와 결합된 2차 항체 결합으로 인한 MFI를 보면 농도에 따라 항원 양성 세포에 대한 mAb 결합이 증가하지만, 항원 음성 세포에 대한 결합은 IgG 대조군과 유사한 것을 볼 수 있습니다. 

하나의 웰로 혼합배양한 여러 종류의 세포에 대해 mAb 결합을 동시에 평가하여 소량의 샘플로 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

그림 5. 하나의 웰로 다양한 종류의 항원 발현 세포에 대한 항체 결합 분석

(A) 결합된 항HER2 항체를 사용해 부착세포주 3개(AU565, MCF7, BT474)의 HER2 발현을 분석하고, HER2에 대해 음성을 나타내는 Ramos 세포의 발현과 비교했습니다. 상대적 HER2 발현은 AU565 > BT474 > MCF7 순서로 나타났습니다. (B) 항체 결합 분석 시 세포를 구별할 수 있도록 AU565 세포는 고농도 iQue^® 세포 확산 및 라벨링 염료(V/Blue)로, MCF7 세포는 저농도 염료로 표지했고 BT474 세포는 무표지 상태로 사용했습니다. (C) 3개 세포주에 대한 트라스투주맙의 결합은 상대적인 HER2 발현 수준(AU565 > BT474 > MCF7)을 그대로 반영했습니다. (D) 트라스투주맙 결합 EC50 값은 3개의 세포주에서 유사하게 나타났습니다(±95% 신뢰구간).