구상체 T세포 살해 분석을 통한 T세포 표현형 및 기능 연구

구상체를 정교하게 탈리할 수 있는 재현성 높고 간편한 프로토콜을 사용해 고형종양에 대한 T세포의 반응을 분석합니다.

그림 1b.  분석과정 - iQue^® 구상체 살해 분석을 위한 분석 프로토콜

3D 고성능 세포 모델로 종양세포 살해 도중 T세포 표현형과 기능을 구별합니다.

그림 2a. iQue^® 고성능 유세포분석으로 종양 구상체의 T세포 살해 중 세포 하위 군집과 사이토카인 분비 정량화

Incucyte^® Nuclight green으로 라벨링한 MDA-MB-231 세포(2.5K/웰)를 2.5% Matrigel^®과 함께 ULA 플레이트에 시딩하고, 구상체가 형성되도록 72시간 동안 배양했습니다. 라벨링하지 않은 PBMC를 첨가하고(E:T = 5:1), ImmunoCult™ 인간 CD3/CD28/CD2 T세포 활성제를 사용해 활성화를 유도했습니다. 1일 차, 3일 차, 7일 차에 동일한 플레이트를 탈리한 뒤 iQue^® 인간 T세포 살해 키트로 T세포 표현형을 분석했습니다. (A)는 1일 차부터 Immunocult 농도가 가장 높은 7일 차까지 타깃 세포의 생존성이 감소한 것을 보여줍니다. T세포 활성화 표지자(B)와 탈진 표지자(C) 발현은 3일 차까지 증가하다가 7일 차까지 감소합니다. T세포 매개 종양세포사 유도에 직접적으로 관여하는 단백질 분해효소, 그랜자임 B의 분비(D)는 Immunocult 농도와 함께 증가했습니다.

그림 2b. 동역학 사이토카인 분석을 위해 소량의 상층액 샘플로 시간에 따른 T세포 기능 연구

BT474 구상체(2.5K/웰)를 72시간 동안 형성시키고, PBMC(12.5K/웰)와 CD3/CD28 Dynabead를 첨가했습니다. 상층액 샘플(10µL)을 1일 차, 4일 차, 8일 차에 채취하고, iQue Qbeads^®로 사이토카인 농도를 측정했습니다. T세포 활성화를 나타내는 사이토카인, IFNγ와 TNFα의 농도는 Dynabead 밀도와 시간에 따라 증가했습니다.  세포독성 림프구에 의한 타깃 세포 살해에 직접적으로 관여하는 단백질 분해효소, 그랜자임 B의 분비도 늘었습니다. 기억 T세포 형성 빈도와 관련이 있는 사이토카인, IL-10의 생성은 4일 차까지 증가하다가 8일 차까지 감소했습니다. 

빠른 샘플링 속도로 반복실험, 다중 키트 분석, 고처리량 정량을 신속하게 수행할 수 있습니다. 

그림 3. 빠른 분석 속도로 여러 T세포 특성분석 키트를 사용해 폭넓은 표현형 분석

Incucyte^® Nuclight green으로 라벨링한 BT474 구상체(2.5K/웰)를 72시간 동안 형성시키고, PBMC(12.5K/웰)와 CD3/CD28 Dynabead를 첨가했습니다. 반복실험 플레이트의 세포를 1일 차, 4일 차, 8일 차에 iQue^® 인간 T세포 활성화 키트, 살해 키트, 탈진 키트로 분석했습니다. (A)는 CD3 양성 군집 중 CD25 양성 세포를 나타낸 플레이트 뷰 그래프입니다. (B)는 시간에 따라 타깃 세포의 생존성이 감소하는 것을 보여줍니다. (C)는 1일 차부터 초기 활성화 표지자 CD69의 발현이 증가하다가 4일 차부터 감소하는 것을 보여줍니다. (D)는 후기 활성화 표지자, CD25의 발현이 4일 차와 8일 차에 특히 강화된 것을 나타냅니다. (E)에서는 초기 T세포 탈진을 나타내는 PD-1의 발현이 4일 차에 가장 높은 것을 볼 수 있습니다.

빠른 샘플링 속도로 반복실험, 다중 키트 분석, 고처리량 정량을 신속하게 수행할 수 있습니다. 

그림 4. iQue Forecyt^®의 프리셋 게이팅 템플릿으로 T세포 하위 군집의 표현형 자동 분석

BT474 구상체(2.5K/웰)를 PBMC와 함께 배양(E:T = 5:1)하고, CD3/CD28 Dynabead로 활성화를 유도했습니다. 24시간 후, iQue^® 인간 T세포 기억 키트로 분석을 수행했습니다. (A)의 그래프는 키트에 포함된 템플릿을 사용한 Tscm(줄기세포 기억 T세포) 및 Tte(종착 작동 T세포)의 게이팅 결과를 보여줍니다. iQue Forecyt^® 소프트웨어에서 바로 추출한 (B)의 히트 맵과 (C)의 농도반응곡선은 Dynabead 농도가 증가함에 따라 초기의 Tscm(줄기세포 기억 T세포) 표현형이 후기 단계의 Tte(종착 작동 T세포) 표현형으로 변화하는 과정을 보여줍니다. 이와 함께 T세포의 자가재생 능력 손실이 동반됩니다.