3D 배양 모델로 종양 미세환경 재현하기

효과적인 3D 스캐폴드 기반 다중 종양 구상체 분석은 어려울 수 있습니다. 기존의 플레이트 리더 분석법은 형태학적 정보 등 이미지 기반 분석이 제공하는 다면적 특성을 파악할 수 없고 이미지로 데이터를 확인할 수 없습니다. 기존의 이미징 시스템은 특성상 다음과 같은 단점으로 인해 시험관 내 배양 모델을 동역학적으로 분석하는 데 사용하기 어렵습니다.

• 불완전한 데이터: 이미징 간격 사이의 정보 누락
• 통제할 수 없는 다수의 환경 변동:  배양기에서 이미징 시스템으로 배양액을 여러 번 옮겨야 하고, 배양기 외부에서 진행되는 3D 이미지 획득 프로토콜에 시간이 오래 소요되어 온도 차이가 발생하고 산소 및 이산화탄소 조건의 통제 상실
• 최적의 이미지 획득 변수를 개발하는 데 긴 시간 소요
• 이미지 처리가 복잡해 정량적 정보를 생성하려면 전문가 필요

Incucyte^® 3D 다중 종양 구상체 분석은 조직 배양기 내에서 실시간으로 종양 구상체의 형성, 성장, 건강을 자동 추적하고 정량화할 수 있는 즉각적인 통합 솔루션을 제공합니다.

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• 재현성 높은 정량적 데이터 생성: 실험실 테스트를 거친 프로토콜, 고품질 이미지, 편향 없는 분석 기술로 약리학적 분석에 적합한 양질의 데이터를 확보합니다.
• 생리학적으로 관련성 높은 정보 획득: 단층 위에서, 또는 Matrigel^®에 포매하여 배양기 내에서 그대로 3D 다중 종양 구상체 배양액의 성장을 무표지 방식으로 정량화하고 형태를 연구합니다.
• 시간에 따른 세포 변화 분석: 비교란성 시약을 사용한 실시간 Multiplex 생존성 및 독성 측정으로 작용기전을 연구합니다.
• 생물학적으로 관련성 높은 혼합배양 분석 수행: 다른 종류의 세포를 첨가해 종양 미세환경을 재현하고 시간에 따른 세포 변화를 연구합니다.

실험실 테스트를 거친 프로토콜, 고품질 이미지, 편향 없는 분석 기술로 약리학적 분석에 적합한 양질의 데이터를 확보합니다.

그림 1. 실험실 테스트를 거친 Incucyte^®의 다중 구상체 프로토콜을 사용하면 3D 세포 배양 기법의 문제 해결에 드는 시간을 줄일 수 있고, 시행착오 접근법 없이도 정량적 분석을 위한 이미지를 획득할 수 있습니다.

단층 위에서, 또는 Matrigel^®에 포매하여 배양기 내에서 교란 없이 그대로 3D 다중 종양 구상체 배양액의 성장을 무표지 방식으로 정량화하고 형태를 연구합니다.

그림 2(동영상). 다중 구상체 성장 모니터링 및 시간에 따른 구상체 형태의 차이 연구. MCF-7과 MDA-MB-231 세포를 시딩(세포 1K개/웰)하고, 3일 동안 단층 Matrigel^® 위에 두거나 베이스 위 Matrigel^®에 포매하여 다중 구상체를 형성시켰습니다. 시간에 따른 구상체 성장(형성 후 0~7일)을 보여주는 타임랩스 동영상을 통해 둥근 다중 구상체(MCF-7)와 별 모양 다중 구상체(MDA-MB-231) 사이의 형태 차이를 관찰할 수 있습니다.

그림 3. 실시간 분석을 사용한 세포 유형별 무표지 성장 프로파일 정량화. MCF-7과 MDA-MB-231 세포를 플랫바텀 96웰 플레이트에서 베이스 위 Matrigel^®(세포 1K개/웰)에 포매하여 3일 동안 다중 구상체를 형성시켰습니다. 부분별(노란색 외곽선)로 나뉜 DF 명시야 이미지와 이에 해당하는 시간별 데이터를 보면 세포 유형별로 동역학적 성장 프로파일을 확인할 수 있고, 캄프토테신의 구상체 성장 억제 효과를 보일 수 있습니다.

비교란성 시약을 사용한 실시간 Multiplex 생존성 및 독성 측정으로 작용기전을 연구합니다*.
*형광 이미지는 단층 Matrigel^® 모델 위의 다중 구상체를 사용해야 획득할 수 있습니다.

그림 4. 동역학적 Multiplex 성장 및 건강 측정으로 세포독성 및 세포증식억제 작용기전 규명. A549-Nuclight Red 세포(세포 2K개/웰)를 Incucyte^® Annexin V Green 염료(1%)와 함께 시딩하고 3일 동안 구상체를 형성시켰습니다. 구상체는 다양한 농도의 캄프토테신(CMP) 또는 사이클로헥시미드(CHX)로 처리하고 6일 동안 이미징했습니다. (A)는 처리 4일 후 명시야(BF, 상단), Incucyte^® Nuclight Red 염료(생존성을 나타내는 핵 제한 FP, 적색 형광, 중간), Incucyte^® Annexin Green 염료(세포자멸사 표지자, 녹색 형광, 하단) 이미지를 비교한 것입니다. (B)는 CMP 처리 구상체에서 관찰된 성장 없음(시간에 따른 BF 영역), BF 경계 내 총 적색 강도의 손실(시간에 따른 적색 형광), 동시에 나타난 평균 녹색 형광 강도의 증가(시간에 따른 녹색 형광)를 보여줍니다. CHX의 구상체 성장 억제에도 불구하고 RFP 발현은 높았고, 녹색 형광의 증가는 미미한 수준이었습니다. 알려진 세포증식억제 약물에서 예상할 수 있었던 최소한의 세포사만 관찰되었음을 알 수 있습니다. 처리 후 0~6일 사이의 AUC 데이터를 사용한 CMP EC₅₀를 보면 농도에 따라 생존성이 감소하고 세포자멸사가 증가했지만, CHX EC₅₀의 경우 생존성 변화가 거의 없고 세포자멸사가 증가하지 않아 예상했던 작용기전을 확인할 수 있습니다. 

그림 5. 생리학적으로 관련성 높은 조건에서 재현성 있고 확실한 약리학적 분석 수행. MCF-7-Nuclight red 다중 구상체를 3일 동안 형성시킨 뒤 7일 동안 알려진 세포독성 화합물로 처리했습니다. 시간별 플레이트 뷰를 보면 구상체 크기(전체 BF 면적)와 생존성(BF 경계 내 적색 형광 강도)을 빠르게 시각화해 볼 수 있습니다. 농도반응곡선은 처리 후 0~7일의 시간별 데이터에 대한 곡선 아래 영역(AUC) 분석을 나타냅니다. 모든 화합물은 농도에 따른 성장 및 생존성 억제를 나타냈으며, 화합물 효능은 CMP > CHX > OXA 순서로 높았습니다.

다른 종류의 세포를 첨가해 종양 미세환경을 재현하고 시간에 따른 세포 변화를 연구합니다.

그림 6. 간질세포가 종양 다중 구상체의 형태에 미치는 영향을 시각화 및 정량화하고, 종양 다중 구상체 내 면역세포 매개 독성 평가. (A) MDA-MB-231 세포를 플랫바텀 96웰 플레이트에서 단독으로, 또는 NHDF와 혼합(1:1 비율, 각각 세포 1K개/웰)하여 Matrigel^® 단층에 시딩한 뒤 다중 구상체 형성을 기다렸습니다(3일). Incucyte^® DF 명시야(DF-BF) 이미지를 통해 3일에 걸친 단독 배양과 혼합배양 조건을 비교할 수 있습니다(세포 시딩 6일 후). NHDF이 시간에 따라 구상체 형태에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. (B) 안정적으로 세포질 제한 GFP를 발현하는 BT474 세포를 Matrigel^® 단층 위에 시딩(세포 1K개/웰)한 다음, 3일 동안 다중 구상체를 형성시키고 갓 분리한 PBMC(E:T = 5:1)와 헤르셉틴을 첨가했습니다. Incucyte^® DF-BF 및 형광 이미지(7일)를 통해 PBMC(노란색으로 표시한 명시야의 외곽선)가 없을 때(상단)와 있을 때(하단) 헤르셉틴이 구상체 확산에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다. PBMC가 있을 때 형광 강도의 감소를 볼 수 있습니다. 또한, 시간별 데이터상 헤르셉틴 농도에 따라 녹색 형광이 감소하는 것을 통해 생존 가능한 타깃 세포의 감소를 알 수 있습니다. 헤르셉틴에 대한 농도반응곡선은 HER2 양성 및 HER2 음성 다중 구상체의 민감도 차이를 보여줍니다(각각 BT-474 vs MCF7).