실시간 세포분석 기법을 바탕으로 한 대식세포 기능의 이해

세포 분화의 확인 - 그림은 불멸화 THP-1 세포 및 혈액 유래 일차 단핵구의 분화 과정 중 발생하는 형태학적 변화를 모니터링 한 결과입니다. THP-1 세포를 5ng/mL PMA에 48 시간 동안 노출시키면 M0 대식세포로 분화되며, 일차 단핵구는 M1 유사 표현형 (50ng/mL GM-CSF에서 6일 간 배양, 직후 1ng/mL LPS + 20ng/mL IFN-γ에서 1일 간 추가 배양) 또는 M2 유사 표현형 (50ng/mL M-CSF에서 6일 간 배양, 직후 20ng/mL IL-4에서 1일 간 추가 배양)으로 분화되었습니다. 형태학적 특성은 M1 세포 군집의 경우 에그 프라이형, M2 세포 군집의 경우 방추상 세포와 에그 프라이형이 혼합된 형태로 나타나 기존 연구 결과(Young et al, J Immunol, 1990)와 일치하였습니다.

세포 분화의 추적 - 그림은 인간 iPSC 유래 단핵구 (0일차 ~ 7일차) 분화의 형태학적 특성을 보여주는 위상 이미지로, 최종적으로 대형 소포체를 포함하는 인간 iPSC 유래 대식세포로 분화되는 모습을 담고 있습니다. 분화는 유지 배지에 100ng/mL M-CSF를 최소 7일 간 추가함으로써 유도하였습니다.
 

형태학적 특성과 세포 표면 마커의 시각화를 바탕으로 한 분화 연구 그림은 THP-1 단핵구와 CD11b, CD14 또는 CD40에 복합화 된 Incucyte^® Fabfluor-488 항체를 배지 (미분화 배지) 단독, 비타민 D3 또는 PMA에 각각 노출한 결과입니다. 세포 형태학적 (HD 위상대조 이미지) 변화량이 배지 단독 또는 비타민 D3 처리 시 대비 PMA 노출 시에서 가장 확연하게 나타났으며, 동역학 그래프에서 또한 차등적이나 배지 단독 시 대비 물질을 처리하였을 시에 대체로 시간 의존적으로 표면 단백질의 발현 추이가 관찰되었습니다.

단핵구 성숙도의 생물학적 의의 - 도표는 미접촉(naive) THP-1 세포 또는 PMA 분화된 THP-1 세포 (M0)를 ClearView 화학주성 멤브레인에 시딩한 후, 섬유결합소로 코팅하고 각 농도의 C5a에 노출하여 Incucyte를 사용하여 시간 단위로 이미지를 획득한 결과를 그래프로 나타낸 것입니다. 약리작용 반응 분석은 30 시간 째(t=30)에 시행하였습니다. 대식세포 유사세포인 분화된 THP-1 세포는 C5a에 대해 강력한 농도 의존적 반응을 보였으며, 이는 분화 전의 THP-1 세포에서는 극히 미량으로 관찰되거나 전혀 관찰될 수 없었던 것입니다.

대식세포 화학주성 동역학적 모니터링의 중요성 - 도식은 일차 단핵구를 M2 유사 표현형 (50ng/mL M-CSF에서 6일 간 배양, 직후 20ng/mL IL-4에서 1일 간 추가 배양)으로 분화시킨 후, ClearView 화학주성 멤브레인에 대식세포를 시딩하고 Matrigel로 코팅한 후 각 농도의 C5a에 노출하여 Incucyte를 사용하여 시간 단위로 이미지를 획득한 결과를 그래프로 나타낸 것입니다. 멤브레인 하부에서 위상 분석을 시행하고 4.5 시간, 11 시간 시점에 약리작용 반응을 각각 분석한 결과로, 고농도에서의 반응 지연으로 인해 시간 의존적인 C5a 효능 변화가 상당 수준으로 관찰되었는데, 이는 호중구를 사용하였을 때는 관찰되지 않았던 반응인 만큼 특이한 반응으로 판단됩니다.

대식작용의 정량 - iPSC 유래 대식세포 (Axol Bioscience)가 Incucyte^® pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^®를 시간 의존적, 세포 수 의존적으로 포식하는 바, pHrodo^® Green E. coli Bioparticles^® (웰 당 100ug)에서 배양한 iPSC 유래 대식세포를 관찰한 위상대조 및 형광 현미경 이미지 조합에서 Bioparticles^®의 포식을 확인할 수 있습니다. 각 하단에 있는 마스킹 된 이미지는 대식작용의 동역학적 특성을 완전하게 정량 하기 위해 세그먼테이션 기법을 사용한 사례입니다. pHrodo^® Green E. coli Bioparticle만을 단일로 사용하였을 때, iPSC 유래 대식세포에 의한 대식작용의 시간 경로 프로파일 상 세포 수 의존적 증가가 확인됨은 그래프에서 확인할 수 있습니다.

항-CD47 항체에 의한 CCRF 세포의 대식작용 유도 - 항-CD47 항체(B6H12.2)의 농도를 점증 시키며 처리한 라벨링 된 CCRF-CEM 세포를 인간 골수 유래 대식세포(BMDM)에 첨가한 후 (그래프에 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 오차로, n=4)의 결과를 우측 그래프에서 확인할 수 있습니다.

대식세포 내 포식된 세포의 이미징과 정량 - J774.A1 대식세포 내 포식된 Jurkat 세포의 형광 강도는 세포 대식작용의 정도에 비례하여 높게 나타나며, 2분 간격으로 반복 확보한 이미지를 나열하면 이 대식 작용을 육안으로 확인할 수도 있습니다.

세포 분화에 의한 대식작용의 결정 - THP-1를 각각 200nM PMA에 24 시간 동안 노출, 200nM PMA에 24 시간 동안 노출 + 이후 20ng/mL IFNγ + 이후 1µg/mL LPS에 노출, 200nM PMA에 24 시간 동안 노출 + 이후 20ng/mL IL-4에 노출시키면 M0, M1, M2 대식세포로 분화됩니다. 이렇게 분화된 대식세포를 pHrodo red로 라벨링 된 사멸 Jurkat 세포와 함께 배양하면, 포식된 Jurkat 세포의 형광 신호가 얼마나 강한지를 확인함으로써 분화된 대식세포의 대식작용을 평가할 수 있습니다. 이에 입각한 데이터는 좌측과 같으며, THP-1 세포로부터 분화된 M0 및 M2 대식세포가 대식작용이 높았으며, 이로써 M2 대식세포의 항염 기능도 논리적으로 설명된다고 볼 수 있습니다.