실시간 세포분석 기법을 바탕으로 한 중성구 기능의 계량

세포 이동에 연관된 표면 접촉에 의한 세포 이동 측정 - 다수의 기공이 높은 밀도로 배치되어 있는 싸토리우스 ClearView 멤브레인을 사용하면 세포가 화학주성 유인물질 쪽으로 이동하는 과정에서 생물학적 연관성이 높은 표면을 접촉하며 지나게 됩니다. 코팅되지 않은 ClearView 멤브레인에 시딩된 중성구는 화학주성 유인물질인 IL-8, fMLP 쪽으로 이동하지 못하나 (좌측 그래프), 코닝 Matrigel로 코팅된 멤브레인에서는 명확한 화학주성 유인물질 프로파일이 관찰됨을 확인 (우측 그래프)할 수 있습니다. 즉, 이는 인테그린 및/또는 세포 표면 수용체와 기질간의 상호 작용이 중성구 화학주성의 핵심적인 역할을 담당하는 한편, (그래프 상에 관련 데이터가 제시되어 있지는 않지만) 코닝 Transwell^®필터를 사용하는 중성구 이동 연구에서는 멤브레인 코팅 자체가 불필요하기 때문에 중성구 이동에 관한 데이터는 확인될 수 없었음을 시사합니다.

NETosis 세포사멸의 시각화, 정량 - DMSO (1.25% v/v), ATRA (0.1 μM)를 사용하여 HL-60 세포를 중성구로 분화하고, 도출된 다핵 dHL-60 세포를 PMA를 사용하여 자극한 시점으로부터 2시간이 경과하자 핵이 용해되기 시작하였습니다. 이를 확인할 수 있는 HD 위상 이미지와 형광 이미지 상 세포질과 핵질이 혼합되어 위상 이미지 상에서 더 이상 핵이 관찰되지 않는, 즉 NETosis 세포사멸의 형태학적 특징을 확인할 수 있었습니다. 핵은 플라즈마 멤브레인으로 이동된 후 방출되었습니다.

아울러 동역학 데이터 상으로는, Incucyte^® Cytotox Green이 외부 DNA에 결합함으로써 관찰된 PMA 유도 NETosis 세포사멸을 확인할 수 있습니다.

세포 분화에 의한 대식작용의 결정 - HL-60 세포를 0.1µM atRA 및 1.2% DMSO에 5 일간 노출, 중성구로 분화시킨 후 시딩하여 Incucyte^® pHrodo^® Green Bioparticles를 첨가하고 분화된 HL-60 세포의 대식작용을 평가 하였습니다. 그 결과 미접촉(naive) HL-60 세포 또는 분화된 HL-60간의 극명한 차이가 데이터 상으로 확인되었으며, 분화된 세포에서 형광 영역이 상당 수준 증가한 것으로 보아 대식작용이 활발했던 것으로 평가할 수 있습니다.

일차 중성구에 의한 대식작용 - 말초혈액에서 추출한 일차 중성구를 시딩하여 Incucyte^® pHrodo^® Green Bioparticles를 첨가하였습니다. 일차 중성구는 대식작용이 왕성하여 다량의 생물입자를 포식하기 때문에 형광 신호가 증가함을 확인할 수 있습니다.

세포 분화의 추적 - 좌측 위상 이미지 상에서는 1.25% DMSO 및 1µM ATRA를 RPMI + 10% FBS 배지에 첨가함으로써 미분화 HL-60와 중성구 유사 세포로 분화된 HL-60의 차이를, 우측 동역학 데이터에서는 위상 컨플루언스(Phase Confluence)에 따라 검출된 세포 확산도의 차이를 각각 확인할 수 있습니다.

세포 형태 (편심성)의 변화 - 코닝 Matrigel 처리 후 시딩한 전혈 유래 다형핵 중성구(PMN)에서, 서로 다른 농도의 CXCL8에 어떻게 반응하는지를 싸토리우스 Incucyte FabFluor-488로 표지 된 CD11b 항체와 Opti-green Background Suppressor, Incucyte 실시간 세포분석 시스템, 위상 형광 이미지, 녹색 형광 이미지로 각각 캡처하고 그 데이터를 확인한 자료입니다. 세포 형태 변화와 CD11b 발현의 변화를 정량하는데는 Incucyte Cell-by-Cell Analysis 소프트웨어가 사용되었습니다.