신경 퇴화 개요

그림 1. 응집된 타우 펩타이드가 뉴라이트 길이에 미치는 영향에 대한 만성 시험관 내 모델. 원시 쥐 피질 뉴런(rCortical, 싸토리우스)을 PDL로 코팅된 96웰 플레이트에 20,000세포/웰로 시딩하고 연구 기간 동안 Incucyte^®에 배치했습니다. 시딩 8일 후, 세포를 가용화 또는 응집된 타우로 처리했습니다(헤파린 4:1 비율, 37°C에서 5일 동안 산발적으로 회전). 뉴라이트 파생물의 자동 분할 및 정량화를 수행했습니다. 응집된 타우는 농도에 따라 뉴라이트 길이가 감소했으며(80 ± 5 대 166 ± 3%, 2~3회 반복), 응집되지 않은 경우 150 µg/mL에서 뉴라이트 형성이 상당히 억제되었습니다.

그림 2. 파킨슨병의 운동 모델에서 옥시도파민(6-OHDA) 처리는 세포사를 증가시키고 신경돌기의 성장을 감소시킵니다. 쥐의 일차 선조체와 성상세포의 공동 배양을 PDL로 코팅된 96웰 플레이트(각각 20,000세포 및 15,000세포/웰)에 시드하고 Incucyte^® 뉴로라이트-오렌지(싸토리우스)로 감염시켰습니다. 감염 10일 후 배양액을 세포사멸 표지인 인큐사이트® 아넥신 V 그린(0.5%; 싸토리우스)이 포함된 배지에서 6-OHDA(2 - 500 µM)로 처리했습니다. 형광 이미지는 Incucyte^® 라이브 세포 분석 시스템을 사용하여 실시간으로 캡처했습니다. 처리 후 21일 시점에서 6-OHDA 처리(19, 56, 167 µM)와 매개체를 비교한 대표 이미지. 시간 경과 및 약물 반응 곡선은 농도 의존적인 뉴라이트 길이의 감소(주황색)와 이에 상응하는 아넥신 V 신호의 증가(녹색)를 보여줌으로써 약물의 해로운 효과를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM(3개 복제본)으로 표시됩니다.

그림 3. 파킨슨병 모델에서의 뇌 영역 특이성: 6-OHDA는 피질 영역에 비해 흑질 및 선조체 신경세포 성장에 선택적으로 영향을 미칩니다. 쥐의 일차 선조체, 흑질 또는 피질 신경세포 및 성상세포의 공동 배양을 PDL로 코팅된 96웰 플레이트(각각 20,000개의 신경세포 및 15,000개의 성상세포/웰)에 시드하고 Incucyte^® Neurolight-Orange(싸토리우스)로 감염시켰습니다. 감염 10일 후 배양액을 6-OHDA(56 - 500 µM)로 처리했습니다. 형광 이미지는 Incucyte^® 생세포 분석 시스템을 사용하여 실시간으로 캡처했습니다. 막대 그래프와 약물 반응 곡선은 다양한 뇌 영역의 뉴라이트 길이(주황색)에 대한 약물의 선택적 프로파일 효과를 보여줍니다. 매개체 데이터는 뇌 영역에 따른 뉴라이트 형성의 차별적 발달을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM(3개 복제본)으로 표시됩니다.

그림 4. 기능 평가 결과, 타우는 연결성을 유지하면서 신경세포 활동의 손실을 유도하는 것으로 나타났습니다. 쥐 피질 신경세포와 쥐 성상세포(Neuroprime^®, 싸토리우스)를 PDL 코팅 96웰 플레이트에 공동 배양(각각 25,000 및 15,000 세포/웰)으로 종자화했습니다. 뉴런에 유전적으로 라벨, 라벨링된 칼슘 지표인 Incucyte^® 뉴로버스트-오렌지(싸토리우스)를 감염시켜 칼슘 변동을 측정함으로써 시간에 따른 자발적인 뉴런 활동을 모니터링했습니다. 이미지 촬영은 24시간마다 Incucyte^®(초당 3프레임으로 3분 스캔) 시스템에서 이루어졌습니다. 성숙하고 기능적인 네트워크가 형성된 후(14일), 세포를 AD 관련 펩타이드 타우(응집, 300μg/mL) 또는 단백질 포스파타제 억제제 OKA(50 nM)로 처리했습니다. 이미지는 전체 스캔에 대한 활성 범위(최대/최소 형광)를 보여줍니다. 칼슘 흔적은 시야 내에 있는 모든 활성 물체의 칼슘 변동을 나타냅니다. 막대 그래프는 활성 물체 수(1/이미지)와 상관관계(연결성)의 정량화를 제공합니다. 이 데이터에 따르면, 타우 치료는 매개체에 비해 활성 노드 수(1407 ± 94개/영상 대 920 ± 43개/영상)와 평균 강도(13.7 ± 1.7 OCU 대 7.2 ± 3.6 OCU)를 감소시킨 반면 상관관계(0.95 ± 0.01 대 0.97 ± 0.01, 2 복제)에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 반면, OKA는 매개체에 비해 활성 노드 수(180 ± 24 개체/이미지), 평균 강도(3.8 ± 0.3 OCU)는 물론 상관관계(0.27 ± 0.02, 6개의 복제본)도 감소했습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다.

그림 5. 2D 및 3D의 환자 유래 AD iPSC 모델에서 뚜렷한 뉴라이트 발달과 구상체 형성을 확인할 수 있습니다. 건강 및 AD(PSEN1 돌연변이) 유래 iPSC 뉴런(Axol Bioscience)을 25,000세포/웰(2D) 또는 50,000세포/웰의 ULA 96웰 플레이트에 ReadySet + SureBond 코팅 96웰 플레이트에 시드한 후 원심분리(250g; 10분)했습니다. 스페로이드가 3일 동안 형성되도록 허용하고(3D), 공급업체의 프로토콜에 따라 신경세포 분화를 유도했습니다(보충제 A+B). 2D 연구: 뉴라이트 발달은 최대 15일 동안 Incucyte^® 소프트웨어 분석 모듈(싸토리우스)을 사용하여 자동으로 정량화되었습니다. 시간 경과에 따라 환자 유래 AD iPSC 라인은 건강한 대조군보다 뉴라이트 길이가 더 짧은 것으로 나타났습니다(각각 48 ± 3mm/mm2 대 80 ± 3mm/mm2, 3번의 복제). 3D 스페로이드 성장: 최대 15일 동안 명시야 분석을 사용하여 비교란 방식으로 크기 차이를 정량화했습니다. 6일에 선택된 웰에 Matrigel^®(2.25 mg/mL)을 추가하고 9일 동안 스페로이드 본체에서 스페로이드 형태 및 프로세스 발달을 관찰했습니다. 시간 경과에 따라 두 세포주 모두 뚜렷한 구상체 크기를 보였습니다. 사진은 또한 건강한 세포주와 알츠하이머 세포주에 대한 프로세스 개발 능력의 차이를 보여줍니다.