미세아교세포의 특성 분석

• pH 민감성 형광 프로브를 사용하여 이미지와 동영상으로 미세아교세포 식균 작용을 관찰합니다.
• 세포 사멸 세포, 세포 파편, 단백질 응집체 및 생체 입자를 포식할 수 있습니다

그림 1. 미세아교세포에 의한 삼킴을 시각화하고 확인합니다. 주황색으로 표시된 세포사멸 Neuro2A 세포를 포집하는 iPSC 유래 미세아교세포(Axol BioSciences)의 타임랩스 시각화. 이미지에서 세포사멸 표적 세포가 미세아교세포의 세포질로 진입하는 것을 확인할 수 있습니다. Neuro2A 표적 세포를 Incucyte^®용 pHrodo^® 오렌지 세포 라벨링 키트로 라벨링하고 스타우로스포린으로 세포자멸사를 유도했습니다.

• Incucyte^®용 pHrodo^® 오렌지 세포 라벨링 염료에서 유도된 형광 신호의 자동화된 분할
• 세포사멸 Neuro2A 세포 또는 β 아밀로이드 응집체에 대한 식세포 작용 반응의 실시간 분석 Incucyte^®용 pHrodo^® 오렌지 세포 라벨링 키트 for
• 식세포 작용 조절제에 대한 작용 메커니즘 평가

그림 2. 미세아교세포에 의한 식균작용의 실시간 정량화. 세포사멸 뉴런(Neuro-2A)에 pHrodo^® 표지된 iPSC 유래 미세아교세포(Axol Bioscience)를 포식한 대표적 형광 이미지. 표적 세포가 산성 파고솜으로 내재화되면서 세포 내 주황색 형광의 증가가 관찰되었으며, 분할 마스크는 청록색 윤곽선으로 표시되어 있습니다. pHrodo^® 표지 Neuro2A 세포의 사멸세포 제거는 세포 수에 따라 달라집니다. pHrodo^® 표지 Aβ 응집체의 식세포 작용은 시간 및 농도에 따라 달라졌습니다.

그림 3. 식세포 작용 조절 메커니즘의 평가. BV-2 작동세포가 세포사멸을 유도하는 Neuro2A 세포(왼쪽 패널) 또는 대장균 바이오입자(가운데 패널). 사이토칼라신 D(위쪽 패널)는 농도 의존적으로 사멸세포 제거와 식세포 제거를 모두 억제하여 각각 0.16 µM 및 1.5 µM의 IC₅₀ 값을 산출합니다. 반면, aVb3 및 aVb5 인테그린 억제제인 실렌기타이드는 사멸세포 제거를 선택적으로 약화시키는 반면(IC₅₀ 값 0.17 µM), 테스트한 최고 농도(100 µM)에서는 식세포 작용에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 데이터는 사멸세포 제거에 필요한 세포 상호 작용에서는 인테그린의 역할을 뒷받침하지만 박테리아의 식세포 작용에서는 그렇지 않다는 것을 보여줍니다.

• 이미지와 동영상으로 미세아교세포 화학축성 관찰
• Incucyte^®1000~5000개의 세포만 사용 Clearview 96웰 화학축성 플레이트, 희귀하고 고가의 1차 세포 집단의 적은 세포 사용량에 이상적

그림 4. 미세아교세포 화학축성 및 이동 평가. Incucyte^® 클리어뷰 플레이트에서 iPSC 유래 미세아교세포(CDI)의 이미지. 모공은 파란색 원으로 표시되어 있습니다(왼쪽). 미세아교세포는 시간 및 농도 의존적으로 보체 성분 5a(C5a)로 이동하는 것을 보여줍니다.

• 단핵구가 미세아교세포로 분화되는 동안의 형태 변화 추적

그림 5. 미세아교세포로 분화된 iPSC 유래 단핵구(액솔바이오사이언스)의 형태학적 변화 시각화. 미세아교세포의 다양한 모습을 확인할 수 있습니다. 12일 후, 빨간색 화살표는 돌출된 모양을 가진 세포를 강조하고 노란색 화살표는 더 큰 납작한 아메보이드 세포를 보여줍니다. 세포에 14일 동안 2일마다 분화 배지를 공급하고 6시간마다 20배율로 위상 이미지를 획득했습니다.

• 신경염증성 미세아교세포 모델에서 비교란성 Incucyte^® Kinase Akt 녹색/적색 렌티바이러스를 사용하여 Akt 활성의 실시간 변화를 평가합니다.

그림 6. 미세아교세포 Akt 활성에 대한 직간접적인 억제 화합물의 효과 HMC3 미세아교세포에 세포 내 위치가 인산화 의존적인 유전적으로 라벨링된 형광 키나제 전위 리포터인 Incucyte^® Kinase Green/Red Lentivirus로 표지했습니다. 96웰 플레이트에 시드된 세포를 Akt(MK2206)와 업스트림 PI3K(LY294002 및 Wortmannin) 및 다운스트림 mTOR(PP242)를 표적으로 하는 억제제로 처리했습니다. Incucyte^® 생세포 분석 시스템(Incucyte^® 생세포 분석 시스템)을 이용해 HD 위상차 및 형광 이미지를 획득하고 통합 소프트웨어를 이용해 Akt 활성의 지표인 핵 이동비(NTR)를 정량화했다.

플레이트 뷰는 24시간 동안의 NTR 반응을 나타낸 것으로, 네 가지 화합물 모두 농도 의존적으로 Akt 활성의 억제 효과를 나타내며 NTR의 감소로 나타난다. PI3K 억제제인 LY294002와 Wortmannin은 빠른 억제 후 기본 Akt 활성 수준으로 회복되는 반면, 알로스테릭 Akt 억제제인 MK2206과 mTOR 억제제인 PP242는 지속적인 방식으로 Akt 활성을 약화시켰습니다. 데이터를 처리 후 6시간 후의 NTR에 대한 농도반응곡선으로 변환한 결과, MK2206이 가장 강력한 효과를 나타냄을 알 수 있습니다. 녹색 형광 채널의 이미지는 처리되지 않은(매개체) 세포의 형광이 세포질과 핵에 모두 분포되어 있는 반면, MK2206 처리 세포는 핵에 뚜렷한 국소화를 나타내며 이는 Akt 억제를 나타냅니다.