싸토리우스의 라이브 세포 이미징 및 분석 

Anton van Leeuwenhoek은 1674년 기본 현미경으로 살아있는 세포를 처음으로 관찰했습니다. 그 이후로 현대의 세포 이미징 기술은 '빠른' 생물학을 다루기 위해 고배율 또는 고속 이미지 캡처와 같이 세포 내 공간적, 시간적 해상도를 높이기 위해 발전해 왔습니다. 공간적 또는 시간적 디테일이 낮은 기술 발전에 대한 고려가 불필요한 것처럼 보일 수도 있습니다. 그러나 이는 충족되지 않은 주요 사용자 요구를 인식하지 못하는 것입니다:
   

1. 많은 중요한 생물학적 변화는 현재의 이미징 솔루션으로 추적할 수 있는 것보다 훨씬 더 오랜 기간에 걸쳐 일어납니다. 예를 들어, 줄기세포의 성숙과 분화는 몇 시간, 며칠, 때로는 몇 주가 걸릴 수 있어 기존 방법으로는 추적하기 어렵습니다. 
2. 고가의 장비나 파워 유저가 사용해야 하는 복잡한 소프트웨어로 인해 모든 연구자가 이미징 기술에 쉽게 접근할 수 있는 것은 아닙니다. 
3. 현재 솔루션의 처리량은 일반적으로 산업 애플리케이션의 최전선에서 사용하기에는 너무 낮습니다. 
4. 이미징 과정에서 세포의 교란(예: 고정, 환경 제어의 손실)은 원치 않는 오해의 소지가 있는 실험 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 

이러한 요구를 해결하기 위해 새로운 세대의 특수 소형 현미경과 라이브셀 이미징 디바이스가 등장했습니다. 이러한 시스템은 세포 배양기의 통제되고 안정적인 환경 내에 상주하며 24시간 내내 자동으로 반복적으로 분석 마이크로플레이트에서 세포 이미지(위상차, 명시야 및/또는 형광)를 수집하도록 설계되었습니다. 이미지 수집은 비침습적이며 세포를 방해하지 않으므로 필요에 따라 생물학의 전체 및 장기적인 시간 경과를 캡처할 수 있습니다. 데이터는 이미지 단위로 즉시 분석되어 세포 행동에 대한 실시간 인사이트를 제공합니다. 분석된 데이터를 대규모로 제공한다는 점에서 기존의 라이브 세포 이미징과 차별화되는 이 패러다임을 "실시간 라이브 세포 분석"이라고 부릅니다.

라이브셀 이미징 장치에서 획득한 이미지는 관심 있는 샘플에서 생성된 광자에서만 완벽한 초점을 맞춰 수집하는 것이 이상적입니다. 그러나 일반적으로 이미징 시스템에는 다음과 같은 여러 소스로 인해 발생하는 체계적인 수차로 인해 보정이 필요합니다:
   

1. 검출기 이상(예: 검출기 바이어스, 암전류 변동성, 필드 평탄도 및 열 또는 감마선 노이즈) 
2. 광학 문제(평평하지 않은 광학 구성 요소 및 조명 불완전성) 또는 샘플에서 발생한 원치 않는 신호
3. 세포 성분 또는 배지에서 발생하는 자가 형광, 음영과 같은 비생물학적 신호 소스, 샘플 매트릭스 또는 마이크로웰의 메니스커스 효과로 인한 불균일한 조명으로 인해 발생하는 패턴 등

이러한 보정을 수행하려면 각 프로세스의 효과를 알고 있어야 합니다. 이미지, 실험 및 기기 전반에서 측정된 생물학적 신호를 정확하게 캡처하려면 원시 이미지에 대한 조작을 반복할 수 있어야 합니다. 이러한 보정을 수행하는 시스템은 특히 실험 프로세스를 표준화하는 표준화된 분석, 시약 및 소모품(예: Incucyte® 라이브 세포 분석 시스템, 싸토리우스에서 제공하는 분석 및 시약)과 함께 사용할 때 일관성과 사용 편의성을 제공해야 합니다.

이미지를 수집하고 처리하는 일관성은 수집된 데이터를 분석하는 능력에 큰 영향을 미칩니다. 특정 과학적 질문에 필요한 도구만 제공하는 특수 제작된 소프트웨어는 이미지 분석 워크플로우에서 시간이 오래 걸리는 단계를 가속화할 수 있습니다.

기존의 소형 현미경은 일반적으로 한 번에 하나의 마이크로플레이트 또는 플라스크에서만 이미지를 캡처하지만, Incucyte®와 같은 라이브셀 이미징 및 분석 장치는 여러 마이크로플레이트에서 이미지를 자동으로 병렬로 캡처하고 분석하여 처리량을 크게 증가시킵니다(예: Incucyte® = 6 x 384 웰플레이트). Incucyte® 라이브셀 분석 시스템은 고유한 이동 광학 경로 설계를 통해 세포와 세포 플레이트가 전체 실험 동안 고정된 상태로 유지되므로 세포 교란을 최소화하고 부착성 및 비부착성 세포 유형 모두의 이미징 및 분석이 가능합니다.

실시간 라이브 세포 이미징 및 분석은 이제 2차원 및 3차원 모델을 포함한 광범위한 표현형 세포 분석에 적용되고 있습니다:
   

• 세포 증식
• 세포 사멸 및 세포 자멸사
• 면역 세포 사멸
• 이동
• 주화성
• 혈관 신생
• 뉴라이트의 성장과 
• 식균 작용

분석의 전체 과정 데이터와 '미니 동영상'은 엔드포인트 분석보다 더 큰 생물학적 통찰력을 제공합니다. 곡선 아래 면적, 신호 시작 시간 또는 임계값, 속도 매개변수(dx/dt)와 같은 새로운 분석은 때때로 매우 부가가치가 높습니다. 엔드포인트 판독에서는 놓칠 수 있는 치료의 일시적인 효과를 키네틱 이미징을 통해 감지할 수 있습니다.

비침습적 특성으로 인해 분석 자체뿐만 아니라 세포 준비 및 '사전 분석' 단계에서도 세포를 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 배양 기간 내내 세포의 형태와 증식 속도를 모니터링하고 마이크로 플레이트에 시딩한 직후에 처리 전 기준선 측정 또는 관찰을 결정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포와 분석 플레이트의 품질을 관리하면 예상되는 세포 형태를 가진 건강하고 균일한 배양액에서만 실험을 수행하여 분석 성능과 일관성을 개선할 수 있습니다.

실시간 라이브 세포 이미징 및 분석 방식은 실험이 진행되는 동안 데이터에 기반한 의사 결정을 내릴 수 있는 기회도 제공합니다. 예를 들어, 실시간 데이터를 사용하여 평형 반응이 발생하는 시점을 파악하고 약물 세척 연구를 수행하여 세척 체제의 타이밍을 트리거할 수 있습니다. 어떤 이유로든 실험이 예상대로 수행되지 않는 것으로 밝혀지면 치료를 보류하여 값비싼 시약을 절약하고 후속 실험을 더 빨리 시작하여 시간을 만회할 수 있습니다.

실시간 라이브 세포 이미징 및 분석은 표현형 분석의 개발, 검증 및 문제 해결에 매우 유용합니다. 사용자는 분석 신호와 처리, 세포 도금 밀도, 플레이트 코팅 및 기타 프로토콜 매개변수 간의 시간 경과에 따른 관계를 명확하게 이해할 수 있습니다. 각 웰의 동역학 데이터 이미지를 면밀히 조사하면 분산 원인을 신속하게 찾아내고 관심 있는 생물학을 검증하는 데 도움이 됩니다. 이는 프로토콜 파라미터의 순열과 조합(예: 세포 도금 비율)이 훨씬 더 많고 생물학이 더 복잡한 공동 배양과 같은 고급 세포 시스템의 경우 특히 그렇습니다.

실시간 라이브 세포 이미징 및 분석은 세포 생물학의 가능성과 워크플로우를 재정의하고 있습니다. 사용 편의성, 처리량, 장기적인 안정성 및 비침습적 측정의 결합으로 연구자들은 이전에는 불가능했거나 적어도 매우 비현실적이었던 방식으로 세포의 행동을 대규모로 모니터링하고 측정할 수 있습니다.

이미징 기술의 지속적인 발전, 이미지 분석을 지원하는 인공 지능의 활용, 환자 유래의 복잡한 세포 모델의 활용은 과학적 통찰력과 새로운 치료법 개발로 이어질 것입니다. 손으로 그린 이미지로 미생물을 처음 기록하던 시대에서 시공간적 사건을 실시간으로 포착할 수 있는 시대로 우리는 먼 길을 걸어왔습니다.

고정된 셀은 셀을 제자리에 '고정'하는 고정 단계에 의해 보존됩니다. 고정 세포는 세포 기능에 대한 정적 스냅샷을 제공합니다. 세포 구성은 손상되지만 단백질, 세포 소기관, DNA와 같은 큰 구조는 보존됩니다. 고정 과정은 세포를 사멸시켜 외부 세포막을 살아있는 세포보다 더 투과성 있게 만듭니다. 따라서 염료와 항체로 세포 내부 구조를 표적으로 삼기가 더 쉬워집니다. 고정된 세포를 이미징하면 세포 하부 구조의 고해상도 이미징이 가능합니다. 

그러나 고정된(죽은) 세포는 생물학적 기능에 대한 동적 통찰력을 제공할 수 없으며 살아있는 시스템을 대표하지 않습니다. 살아있는 세포 이미징은 세포가 살아있는 상태에서 이루어집니다. 시간이 지남에 따라 이미지화하면 실시간 동적 데이터를 수집하고 엔드포인트 고정 세포 분석에서 놓칠 수 있는 이벤트를 포착할 수 있습니다.

살아있는 세포 이미징 및 분석에서 중요한 것은 세포의 공간적(고해상도) 및 시간적(타임랩스 이미징을 통한) 정보를 모두 해결할 수 있는 능력에 있습니다. 살아있는 세포 이미징 및 분석은 세포 모델의 건강, 형태, 움직임 및 기능에 대한 동적 인사이트를 제공합니다. 라이브 세포 이미징 및 분석을 통해 세포 기능에 대한 스냅샷만 제공하는 일반적인 엔드포인트 분석으로는 불가능한 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이는 종양 세포를 표적으로 하는 항암제의 실시간 효능을 확인할 수 있는 면역 종양학이나 항암제가 있을 때 종양 세포의 이동이 어떻게 제한되는지 확인할 수 있는 세포 이동 분석과 같은 어플리케이션에서 중요합니다. 

라이브셀 이미징 및 분석은 실험이 진행되는 동안 데이터에 기반한 의사결정을 내릴 수 있는 기회도 제공합니다. 예를 들어, 혈관 또는 신경 네트워크의 생물학을 연구하는 연구자는 화합물 치료나 유전자 조작(예: siRNA)의 효과를 평가하기 전에 먼저 안정적인 네트워크를 구축하고자 할 수 있습니다. 지속적인 라이브 세포 이미징 및 분석을 통해 네트워크 매개변수를 시간적으로 추적하고 실시간 데이터를 사용하여 치료 요법을 시작하기에 가장 좋은 시기를 판단하는 것이 간단합니다. 상청액의 대사 산물 또는 분비 단백질 분석과 같은 보조 연구의 타이밍도 안내할 수 있습니다.

세포 치료의 모든 영역을 연구할 때는 살아있는 세포 이미징과 분석을 사용해야 합니다. 기존의 엔드포인트 분석은 세포 이벤트에 대한 단일 측정만 제공합니다. 세포는 본질적으로 역동적이기 때문에 보다 심층적인 생물학적 통찰력을 얻기 위해서는 실시간으로 이미징할 수 있는 능력이 중요합니다. 라이브셀 이미징 및 분석은 일반적으로 면역학, 종양학, 면역 종양학 및 신경과학과 같은 치료 분야에서 세포의 건강과 증식, 세포 이동 및 형태, 세포 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

이미지는 일반적으로 현미경 기술을 사용하여 시각화합니다. 광학 현미경은 대부분의 실험실에서 사용되는 표준 도구로 최대 200nm 범위까지 구조를 시각화할 수 있습니다. 최신 고해상도 이미징 기술의 발전과 형광 프로브의 합성으로 이제 10~50nm 규모의 라벨이 부착된 세포 하부 구조를 볼 수 있게 되었습니다. 기술 발전과 함께 복잡성과 비용도 증가하고 있으며, 고해상도 현미경은 광범위한 교육이 필요하고 접근이 제한되는 경우가 많습니다. 

고함량 스크리닝 및 분석 시스템은 형광 현미경과 분석 소프트웨어를 결합하여 실시간 세포 데이터를 시각화 및 분석하는 벤치탑 시스템입니다. 이러한 시스템은 일반적으로 조직 배양 인큐베이터 내에 설치되지 않으므로 환경 안정성 및 장기 연구 측면에서 제한적입니다. 

다중 모드 판독기는 발광, 형광, 시간 분해 형광 및 흡광도 중 두 가지 이상을 감지할 수 있는 마이크로 플레이트 판독기입니다. 멀티 모드 리더 내의 이미징 시스템은 분석 중에 웰을 이미지화할 수도 있습니다. 이러한 시스템에는 적절한 환경 제어 기능이 없기 때문에 장기 연구에 영향을 미칠 수 있습니다. 

라이브 세포 이미징 및 분석 시스템은 실시간으로 발생하는 세포 이벤트를 캡처하도록 설계되었습니다. 연구자들은 세포가 무엇을 하고 있는지에 대한 전체 그림을 제공하지 못하는 단일 시점이 아니라 시간에 따른 일련의 데이터 포인트를 분석할 수 있습니다.  

Incucyte®와 같이 인큐베이터 내에 설치된 라이브셀 이미징 및 분석 시스템은 세포를 안정적이고 최적의 환경으로 유지하면서 며칠에서 몇 달에 걸쳐 실시간 연속 분석을 수행할 수 있습니다. 다중 모드 판독기 및 고함량 이미저와 같은 많은 기술은 환경 제어 기능이 없기 때문에 세포가 생리적으로 적합한 조건으로 유지되지 않습니다. 

또한 어플리케이션 요구 사항에 따라 최대 6개의 마이크로플레이트를 병렬로 실행할 수 있어 일반적인 현미경 검사 및 단일 플레이트 리더기보다 더 많은 처리량을 처리할 수 있습니다. 이 외에도 Incucyte®는 사용자 친화적으로 설계되었습니다. 시약이 각 용도에 맞게 최적화되어 있어 분석 준비가 쉽고 직관적인 소프트웨어가 각 단계를 사용자에게 안내합니다.