실험: 단백질 정제, 분석

단백질 정제를 위한 목적으로 세포배양을 수행하신다면 아마 여과, 정제, 농축 공정에 많은 시간을 소모하게 될 것입니다. 이들 공정을 수행하는 동안, 특히 단백질 정제를 여러 날에 걸쳐 실시하게 되는 경우에는 단백질에서 침전과 퇴화가 발생하는 등 단백질 소실이 발생한다는 어려움이 존재하기 마련이지만, 올바른 장비를 활용하여 단백질 소실의 확률을 줄여줌으로써 공정 효율을 증진할 수 있는 여지는 분명히 있습니다.

사실, 프로토콜을 충실하게 따르는 과정에서도 단백질 소실은 자연스럽게 발생하게 됩니다.

먼저, 세포 용해 시 단백질 소실이 발생하게 됩니다. 세포를 용해하고 상층액을 분리정제하는데 소요되는 수 시간 동안 단백에서는 단백질 가수분해 효소, 즉 프로테아제에 노출됨으로 인한 절단(truncation), 또는 퇴화(degradation)가 일어나게 됩니다.

농축과정에서도 단백질 소실이 발생할 수 있습니다. 정제만 성공적으로 이루어졌다면 농축은 오히려 간단한 것으로 보이지만, 사실 농축 공정에서도 적절한 프로토콜이 준비되어 있지 않거나 프로토콜 준수에 미비점이 있다면 단백질 농축, 즉 원심분리 과정에서 과도한 원심분리속, 원심분리시간으로 인한 단백질 소실이 발생하게 됩니다.

다음은 단백질 투석입니다. 장시간, 여러 공정에 걸쳐 단백질 투석이 실시되는 동안 투석 백, 카세트에서 단백질이 누출됨으로 인한 단백질 소실요인이 있습니다. 백이나 카세트에 육안 상 손상이 없다고 하더라도 단백질 분자가 접혔다 펴지고, 응집과 분해를 거치는 과정에서 자연스러운 단백질 소실이 발생하며, 역시 여러 날 동안 단백질 투석이 이루어 진다면 그 가능성은 더 높아지겠습니다. 이처럼 정제를 성공하고 마지막 단계에서 단백질 소실을 피하지 못한다는 것은 연구자의 입장에서 뼈아픈 손실일 것입니다.

분비 단백질을 활용하시면 별도로 단백질 용해 공정을 실시하지 않아도 되므로, 세포 내 단백질 가수분해 효소가 개입할 여지 자체가 없어집니다. 자연적으로 분비된 단백질이든, 세포 내 단백질을 최적화함으로써 HEK Freestyle 세포 또는 여타의 최적화된 세포주에서 분비단백질을 사용하여 정제할 수 있도록 한 경우이든, 세포는 항상 다량의 상층액으로부터 분리해 내어야 하고, 단백질 샘플을 반드시 농축이 되어야 하는 등 수반되는 어려움이 존재하기 마련입니다.
 

주어진 세포로부터 생리학적으로 유관하며 세포 간의 변동성이 낮은 일관된 정보를 수집하기 위해서는 세포학적 통찰을 보다 정밀하고 신속하게 얻을 수 있는 역량을 확보하는 것이 중요하며, 이는 올바른 이미징 장비와 분석장비를 사용함으로써 달성할 수 있습니다. 우수한 분석 재현성, 방대한 정보량을 확보할 수 있는 장비를 사용할 수 있다면 이와 같은 통찰을 보다 빠르게 얻을 수 있고, 최종적으로 분석결과를 확정하고 다음 분석공정으로 넘어갈 때 까지 소요되는 비용과 시간을 절약할 수 있습니다.

고수율 실시간 세포분석 세포확산, 세포사멸, 세포독성 등 세포 건강도의 측정은 후보물질이 세포 성장, 세포생존성에 미치는 영향을 분석하는데 있어 필수적으로 수반되어야 하는 공정입니다. 측정된 세포 건강도를 바탕으로 후보물질 사이의 순위를 매기고, 표적 외 물질을 식별하며 작용 기전을 결정할 수 있기 때문입니다. 후보물질의 유효농도를 손쉽게 결정할 수 있고, 단 한번의 분석으로 타겟 물질의 교란에 소요되는 시간을 파악할 수 있으므로 후보물질 스크리닝 공정을 보다 빠르게 시행할 수 있다는 점에서 실시간 세포분석법이 기존 평가변수분석법 대비 갖는 장점은 약물 후보물질 평가에 있어 상당하다고 할 수 있습니다. 

보다 구체적으로는, 실시간 세포분석이 가능한 장비를 활용함으로써 96 웰, 384 웰 플레이트에서의 세포배양 이미지를 전자동으로 획득, 분석하여 시계열 데이터를 도출하고, EC50 / IC50의 계산을 위한 농축의존반응을 확인할 수 있습니다.