물리화학적 특성
단백질 기반 치료제는 살아있는 세포에서 제조하는 특징이 있는 만큼 구조적인 이질성을 본질적으로 수반하게 되어 있으며, 단일클론항체 치료제의 개발에 있어 이와 같은 구조적 이질성을 특성분석 하는 것은 필수적으로 수행되어야 할 공정입니다. 특히, 치료제의 체내 안정성에 영향을 미쳐 생물활성 소실, 의도되지 않은 면역반응을 초래할 수 있는 저/고분자량, 전하 변형체, 번역 후 변형 등의 문제도 주목하여야 할 사안입니다.
싸토리우스는 치료 단백질 개발의 적정 시점에 단백질 구조 검증과 물리화학적 분석을 실시, 관련 위험을 효과적으로 관리하고 있습니다.
구체적으로는 최신 기술을 기반으로 한 단백질 구조, 탄수화물 프로파일, 번역 후 변형, 불순도 등의 특성분석을 바탕으로 ICH Q6B 가이드라인 준수를 보장, 가장 효과적인 개발공정을 중단없이 수행할 수 있도록 고객사를 보조하고 있습니다.
고도의 단백질 특성분석 방법론으로, 핵심 물리화학 특성에 대한 고해상도 직교 분석 지원
원형질량분석법을 통한 단백질 1차 구조는 물론, 단백질 2차 구조와 번역 후 변형에 대한 분석까지 지원
구조적 / 물리화학적 특성분석법에 고도의 바이오분석을 병합 실시함으로써 완벽한 단백질 특성분석 수행 가능
IgG와 같은 표준 분자에 대한 분석법의 적격성을 사전에 확인, 고객사 공정에 신속하게 도입 가능
ICH Q6B 기준 | 싸토리우스의 솔루션 |
|---|---|
분자량, 분자 크기 분석 |
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이성질체상 |
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흡광 계수 | 단백질 농도 분석 |
전기영동상 |
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액체 크로마토그래피상 |
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분광 프로파일 |
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분자량 결정은 재조합 단백질 의약품이 설계대로 합성되었는지를 1차적으로 확인하기 위해 필수적으로 수행되어야 하는 공정입니다. 분자량을 측정 함으로써는 염기서열 변형을 검출해 내고 당화와 같은 번역 후 변형이 있는지, 또 어느 정도의 변형이 있는지 등에 대한 고도의 평가가 가능합니다. 싸토리우스의 고해상도 크로마토그래피법과 질량 분광분석법(LC-MS)은 정확도 높은 분자량 정보를 제공, 싸토리우스의 크기 배제 크로마토그래피(sec)와 SDS-모세관 전기영동법을 보조하는 수단으로 활용될 수 있습니다.
특히, 싸토리우스에는 정상 단백질, 탈당화 단백질, 환원 단백질의 질량을 다양한 방법으로 평가할 수 있는 역량과 경험을 갖춘 전문 연구원이 상주하고 있습니다.
원형질량분석법으로는 단백질의 분자량을 분석해 낼 수 있습니다. 분석된 질량을 1차 염기서열 분석에 따라 예측된 질량과 비교함으로써 아미노산 조성을 확인할 수 있음은 물론, 단백질의 주 당형(glycoform)을 포함한 다양한 변형의 원인을 분석할 수 있는 정보 또한 원형질량분석법으로 얻을 수 있습니다.
한편, LC/MS법을 적용하기 전에 IgG를 탈당화하게 되면 N-당화에 연관된 이질성을 배제할 수 있음은 물론, 글리칸 미부착 상태에서의 단백질 골격의 질량을 정확하게 알아낼 수 있으므로 IgG를 탈당화와 원형질량분석법을 조합하여 단백질 1차 구조의 간접적인 밸리데이션을 실시할 수 있게 되는 것입니다.
환원된 단일클론항체를 LC/MS법으로 분석하는 것은 항체를 구성하는 개별 경사슬과 중사슬의 정확한 분자량을 확인하기 위함으로, 원형질량과 탈당화 질량을 확인하는 것에 더하여 작은 단백질 절편을 분석할 수 있게 됨에 따라 미세하게 발생한 변형도 높은 감수성으로 검측해 낼 수 있게 됩니다.
특히, 싸토리우스에서는 CE-SDS 및 SEC를 활용해 Size Variant를 분석하는 보완적 분석법을 통해 분자량과 Size Isoform의 직교 분석을 지원하고 있습니다.
우수한 자동화성, 정량성, 분석속도와 효율을 무기로, 모세관 전기영동(CE)법은 전통적인 평판 겔 전기영동법을 효과적으로 대체하고 있습니다. 이에, 싸토리우스에서도 CE-SDS 기술을 통해 단백질 Size Variant 정보를 보다 정확하게 분석할 수 있는 솔루션을 제공하고 있습니다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)법은 저분산, 고해상도의 크로마토그래피 법으로 단일클론 항체에서의 고분자량/저분자량 variant를 식별하고 결합활성, 기능활성의 결과를 효과적으로 평가할 수 있는 방법론입니다. 또한, ICH Q6b 기준 약물식별(identity), 균일성(homogeneity), 순도(purity)기준의 충족 여부를 확인하기 위한 크로마토그램 패턴에 관한 정보 또한 SEC법을 통해 얻을 수 있습니다.
치료적 단일클론항체의 안정성, 생물활성, 면역원성을 암시할 수 있는 특성인 단백질 응집체 / 분해체, 전하 변이체 이질성으로부터는 클론 세포주, 제조 공정, 약물 안정성 등 바이오 의약품의 개발 과정 전반에 걸쳐 필요로 하는 정보 일체를 얻을 수 있습니다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)법은 저분산, 고해상도의 크로마토그래피 법으로 단일클론 항체에서의 고분자량/저분자량 variant를 식별하고 결합활성, 기능활성의 결과를 효과적으로 평가할 수 있는 방법론입니다. 또한, ICH Q6b 기준 약물식별(identity), 균일성(homogeneity), 순도(purity)기준의 충족 여부를 확인하기 위한 크로마토그램 패턴에 관한 정보 또한 SEC법을 통해 얻을 수 있습니다.
크로마토그래피법을 사용하면 등전점(pl)을 기반으로 순 전하값에 따라 단백질을 분리할 수가 있습니다. 특히, 이온교환 크로마토그래피법(IEX)을 사용하면 매우 경미한 순 전하값의 차이도 분류할 수 있게 됩니다. 복수의 아미노산 측쇄가 갖는 양쪽성 특성을 고려했을 때, 이와 같이 경미한 순 전하값의 차이를 식별할 수 있는 것은 바이오 의약품의 이질성을 파악할 수 있는지 여부를 좌우합니다.
의약품의 순도를 좌우하는 중요 정보를 파악하고자 실시하는 역상 크로마토그래피(RP)법 또한 단일클론항체의 특성을 분석하기 위해 실시하여야 하는 주요 공정입니다. 단백질의 분리는 소수성에 기초하므로, 역상 크로마토그래피를 실시하면 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피와 같은 여타의 크로마토그래피법 간의 직교 선택성을 확보할 수 있게 됩니다. 이와 같은 특성은, 특히 이황결합구조의 상이함으로부터 기인하는 구조적 차이를 유발할 수 있는 IgG2와 관련되어 있는 것입니다.
치료적 단일클론항체의 안정성, 생물활성, 면역원성을 암시할 수 있는 특성인 단백질 응집체 / 분해체, 전하 변이체 이질성으로부터는 클론 세포주, 제조 공정, 약물 안정성 등 바이오 의약품의 개발 과정 전반에 걸쳐 필요로 하는 정보 일체를 얻을 수 있습니다.
Example electropherogram for NIST mAb standard
우수한 자동화성, 정량성, 분석속도와 효율을 무기로, 모세관 전기영동(CE)법은 전통적인 평판 겔 전기영동법을 효과적으로 대체하고 있습니다. 이에, 싸토리우스에서도 CE-SDS 기술을 통해 단백질 Size Variant 정보를 보다 정확하게 분석할 수 있는 솔루션을 제공하고 있습니다.
모세관 등전집중(cIEF)법은 등전점(pl)을 기준으로 전하 변이체를 분리하는 2 단계 기법으로, 등전점으로 구성된 기법입니다. 모세관 등전집중(cIEF)이 때 전하 변이체를 분리하는 기준이 되는 등전점은, 등전점이 알려진 단백질 표준물질을 기준으로 산정합니다. cIEF법은 SCIEX 800 시스템을 사용, 이온교환 크로마토그래피법으로 실시하는 직교 기법입니다.
전하 변이체는 바이오의약품의 안정성과 생물학적 기능성에 영향을 미칠 수 있는 요인입니다. 전하의 이질성은 서열 변이체 (C-말단 리신 클리핑 등), 화학적 분해체 (탈아민화 등), 일부 번역 후 변형 (시알릭산 포함 글리칸 등)로 유래될 수 있으며, 이는 숙주 세포주의 특성에 따라 자연적으로 유래하는 것일 수도, 아니면 상업적 제조에 의해 인공적으로 유래하는 것일 수도 있습니다. 유래가 어떠하든, 이와 같은 이질성을 명확하게 이해, 관리할 수 있을 것을 ICH Q6b 가이드라인은 요구하고 있습니다.
크로마토그래피법을 사용하면 등전점(pl)을 기반으로 순 전하값에 따라 단백질을 분리할 수가 있습니다. 특히, 이온교환 크로마토그래피법(IEX)을 사용하면 매우 경미한 순 전하값의 차이도 분류할 수 있게 됩니다. 복수의 아미노산 측쇄가 갖는 양쪽성 특성을 고려했을 때, 이와 같이 경미한 순 전하값의 차이를 식별할 수 있는 것은 바이오 의약품의 이질성을 파악할 수 있는지 여부를 좌우합니다.
모세관 등전집중(cIEF)법은 등전점(pl)을 기준으로 전하 변이체를 분리하는 2 단계 기법으로, 등전점로 구성된 기법입니다. 이 때 전하 변이체를 분리하는 기준이 되는 등전점은, 등전점이 알려진 단백질 표준물질을 기준으로 산정합니다. cIEF법은 SCIEX 800 시스템을 사용, 이온교환 크로마토그래피법으로 실시하는 직교 기법입니다.
IgG2 동형의 식별을 위한 역상 LC/MS 프로파일링
고해상도 질량분석(MS)과 역상 액체 크로마토그래피(LC)는 단일클론항체 치료제의 프로파일링을 수행하기에 충분히 강력한 분석 방법론입니다. LC/MS 조합은 단백질 분리, 질량 정보를 정확하게 도출할 수 있을 뿐 아니라 항체의 이질성과 안정성에 대해 상세한 정보를 얻을 수 있는 수단임에는 틀림없지만, 현재의 기술로 정상 단백질을 크로마토그래피 상에서 가장 높은 해상도로 분리할 수 있게끔 하기 위하여는 이온쌍 시약을 사용할 수 밖에 없었고, 이로 인한 질량분석의 감수성의 저하도 피할 수 없었습니다.
IgG2 항체의 특성분석을 보다 용이하게 하기 위해, 싸토리우스에서는 감수성 저하 없이 크로마토그래피 상에서 정상 단백질을 고해상도 분리할 수 있는 방법론을 개발하였습니다. 이 방법론은 최근에 들어 고도로 발달한 컬럼 관련 기술을 십분 활용한 것으로, 서로 다른 IgG2 동형을 고해상도로 분리할 수 있음은 물론 다른 면역글로불린 아형항체까지 검출할 수 있습니다. 아울러, 이온쌍 시약의 사용으로 MS 민감도가 개선, 각 IgG 아형항체에 대한 고품질의 질량 스펙트럼 분석이 가능합니다.
Example electropherogram for NIST mAb standard
바이오 의약품의 단백질 샘플 분석 시, 단백질 농도는 그 중요성에 비추어 반드시 다량의 샘플을 사용하여 분석, 결정되어야 합니다.
분광광도법은 가장 흔히 활용되는 단백질 정량법으로, 매질에 특정 파장의 빛을 조사하여 그 흡광도를 측정하는 방식으로 단백질을 정량합니다. 보통 280nm 정도의 파장을 갖는 빛에서 방향족 아미노산의 흡광도가 대단히 우수하기 때문에 해당 파장의 빛을 조사하게 되며, 이 분석법은 파장의 길이에서 이름을 따 ‘A280 분석’이라고 지칭합니다. 매질에 대한 흡광도는 비어-람베르트 법칙에 따라 다음의 식으로 표현할 수 있습니다.
A = εCL
상기의 식에서는, A = 흡광도 ε = 매질자체 흡수율 C = 매질의 농도 L = 빛의 이동거리를 각각 의미합니다.
빛의 이동거리가 고정된 조건에서 분광광도법을 실시할 때에는 매질의 농도를 측정기기의 선형범위 내에 있도록 하기 위한 희석작업이 동반되어야 합니다. 이 희석작업은 시간소모가 클 뿐 아니라, 희석과정 중에 약간의 오차만 발생해도 매질의 최종 농도에서 큰 오차가 발생하는 문제를 피할 수 없다는 단점이 있습니다.
빛의 이동거리 값이 가변한 조건에서 측정 장비를 사용할 수 있다면 앞서 비어-람베르트 법칙에 따른 식에서 L값을 고정할 필요가 없게 되고, 그에 따라 희석작업을 실시할 필요 자체가 없어지게 됩니다. 정확도와 정밀성의 측면에서 탁월한 우수성을 자랑하는 싸토리우스의 분석법은 이동거리값이 고정된 조건에서 실시하여야 하는 기존 분광광도법과 달리 짧은 시간 내에 여러 건의 분석을 실시할 수 있음은 물론, 분석했던 매질을 재사용할 수가 있어 샘플량이 많이 확보되어 있지 않은 경우, 같은 샘플로 다른 테스트를 실시하여야 하는 경우에 샘플을 재사용할 수 있다는 큰 장점이 있습니다.
