레트로바이러스
레트로바이러스 시험 관련 서비스
극도로 복잡한 생활사를 갖는 바이러스과인 레트로바이러스는, 거의 모든 생산세포주에서 프로바이러스로서 내인성의 형태를 띠기 때문에 특히 문제가 됩니다. 예를 들어 CHO 세포의 경우에는 투과전자현미경법(TEM)으로 관찰 가능한 바이러스 미립자를 형성하는 내인성 바이러스를 갖는데, 이 내인성 바이러스는 감염성이 없는 반면, NS0와 같은 마우스 세포주는 감염성이 있는 레트로바이러스를 형성하게 됩니다.
레트로바이러스 테스트는 ICH 가이드라인 (Section 3.2.1)에 따르면, 제조공정 상 마스터 세포은행(MCB), 생산종료(EoP) 세포은행, 그리고 배양회수액(bulk harvest) 등 총 3 단계에서 실시하도록 되어 있으며, 감수성 세포에서의 감염능 분석과 TEM 관찰을 반드시 포함하여 실시되어야 합니다. 이 과정에서 감염성 레트로바이러스가 검출되지 않는 때, 또는 특히 TEM 관찰에서 레트로바이러스 입자나 레트로바이러스 유사 입자가 관찰되지 않는 때는 추가적인 시험을 실시할 것이 요구되며, 이 경우 레트로바이러스 역전사효소를 검출하기 위한 분석법이 사용됩니다.
싸토리우스의 전문 연구원이 고객사의 의약품 개발 공정에 정확하게 필요한 레트로바이러스 연구 시험 계획을 수립하여 드립니다.
공정에 즉시 도입 가능한, 인증된 품질의 시험 계획과 밸리데이션된 cGMP 시험법으로 맞춤식 시험의 수행과 신속한 결과값의 도출이 가능합니다.
내인성 레트로바이러스를 포함하는 것으로 알려진 세포주로부터 도출된 분석결과를 해석, 제품의 출시 / 규제기관 자료제출이 원활하게 이루어질 수 있도록 준비합니다.
싸토리우스의 분석법은 cGMP 적합 분석법으로 유럽약전(EP)과 미국약전(USP) 가이드라인을 준수합니다.
제품의 제조에 사용되는 세포주의 종에 따라 가장 적합한 시험법을 권장하고 있습니다. 내인성 레트로바이러스를 포함하는 것으로 알려진 세포주가 아닌 경우(인간 세포주, 영장류 세포주)는 보통 TEM 관찰법과 역전사효소 활성측정법(PERT)에서 음성의 결과가 도출되어야 합니다. 반면, 내인성 레트로바이러스를 포함하는 것으로 알려진 세포주(햄스터 세포주)의 경우는 TEM 관찰법에서는 양성, 세포 기반 감염능분석에서는 음성의 결과가 각각 도출되어야 합니다. 또한, 제품의 용도 (재조합 단백질의 생산, 바이러스 백신 등 백신 생산, 바이러스 벡터 유전자 치료제 등)에 따라서도 시험법을 달리 권장하게 됩니다.
바이러스 유사입자(VLP)의 경우에는, 감염성만 아니라면 포함되어 있다고 하더라도 무방한 것으로 보고 있습니다.
샘플 | 투과전자현미경법 | 역전사효소 활성측정법 | 확장 S+L 분석법 |
|---|---|---|---|
연구용 세포은행 | - | - | - |
마스터 세포은행 | X | X | X* |
제조용 세포은행 | - | - | X* |
생산종료 세포은행 | X | X | X* |
마스터 바이러스 시드 | X | X | - |
Working Virus Seed Stock | - | X | - |
비정제 배양회수액 | X | X | X* |
원료의약품 | - | - | - |
완제의약품 | - | - | - |
X* – 쥐과 동물 기반 세포주에 한함 (햄스터 등)
200종 세포 프로파일링
포유류 세포주에 주로 적용되는 시험법으로, 최소 200종의 중앙세포 프로파일(유핵세포)을 투과전자현미경법(TEM)으로 프로파일링하는 공정입니다. 세포 프로파일링을 통해서는 세포핵, 세포 소기관, 골지체, 혈장막과 같은 세포의 핵심 구조를 세밀하게 관찰되므로, 세포에 형태학적인 손상이 없는지 여부를 확인할 수 있습니다. 바이러스, 바이러스 유사입자, 세균, 진균, 효모균, 마이코플라즈마를 식별하고, 식별된 바이러스 등이 연관된 세포 프로파일의 비율을 기록하는 것 또한 세포 프로파일링의 목적 중 하나입니다. 이미 식별된 레트로바이러스의 경우에는 바이러스 입자의 유형까지 기록하게 되며, 이와 같은 기록을 통해 제품의 정량/정성적 데이터를 도출, TEM 관찰 결과와 함께 규제기관에 제출하게 됩니다.
Thin-section 전자현미경법
Thin-section 전자현미경법은 주로 벌크 배양회수액 제조에 활용되는 방법입니다. 다이아몬드 나이프와 마이크로톰을 활용하여 극도로 얇은 두께의 검체절편을 도려내고, 이를 아세트산 우라늄과 시트르산 납으로 염색한 후 현미경 관찰을 실시하며, 격자 상 무작위의 10개 사각형에 존재하는 바이러스 입자의 개수를 바탕으로 역가를 계산합니다.
음성염색법
음성염색법을 활용하면 TEM을 고배율로 실시할 수 있어, 검체의 형태학적 특성과 미세구조를 보다 자세히 관찰할 수 있습니다. 부유 세포에 담긴 검체에 불투명 염색(electron-opaque stain)을 직접 실시하고 이 불투명 염색이 검체에 충분히 침투하게 되면 주변과의 대비가 나타나게 되며, 이 때 정해진 농도의 라텍스 비드와 혼합하여 검체 내 바이러스 유사입자의 역가를 도출하는 방법입니다.
형광 역전사효소 활성측정법(FPERT)은 RNA로부터 DNA를 전사하는 효소로, 모든 레트로바이러스에 존재하는 역전사효소의 활성도를 고감수성으로 평가하기 위한 방법입니다.
qPCR 기반 방법론으로, TEM법이나 세포 기반법 대비 빠르게 결과를 얻을 수 있습니다.
확장 S+L 분석법은 MCB, WCB, EoP 세포은행 샘플에 감염성 레트로바이러스가 존재하는지 여부를 확인하기 위한 한계 시험으로, 감염성 쥐 레트로바이러스를 검출하여야 할 시에 (CHO 세포 또는 쥐 세포의 세포은행 시험 시에 주로 활용) 적용합니다.
Mus dunni 세포를 사용하여 Moloney MLV를 제외한 4개 유형의 양생 또는 친이종 쥐 백혈병바이러스(MLV)에 감염시킨 후, 밍크 세포주인 MiCl1, 고양이 세포주인 PG4를 사용하여 MLV를 분석해 내는 원리로 분석을 실시합니다.
