미생물 오염
다양한 미생물 시험에 적용할 수 있는 미생물 오염 검출법
미생물 오염의 위협은 바이오의약품 생산 각 공정에서 도사리고 있습니다. 한 번 오염이 일어나면 진균 / 세균은 기하급수적으로 증식하기 때문에 완제 의약품에서의 현저한 품질저하를 피할 수 없을 뿐더러, 포유류 세포주를 사용하는 경우에는 마이코플라즈마, 마이코박테리움 오염의 가능성 또한 우려하여야 합니다.
백신과 같은 바이오의약품에 미생물 오염이 있었다면 의약품 자체의 품질저하는 물론, 투여되었을 때 환자의 건강에 상당한 영향을 미치게 되는 이유로 FDA, EMA 등 각국의 규제기관에서는 미생물오염에 대해 대단히 엄격한 시험기준을 적용하고 있습니다. 규제기관에서는 보통 몇 종의 대표적인 미생물 샘플이 제품 내에서 관찰되는지를 식별하는 방식으로 하는 시험을 통과할 것을 요구하게 되며, 이와 관련하여 완제의약품에 미생물 오염이 없음을 근거하는 서류를 규제기관에 제출하여야만이 바이오의약품의 시장 출시가 가능합니다.
싸토리우스에서는 미생물오염 시험조건을 충족할 수 있는 다양한 바이오 안전성 분석 시험 패키지를 다음과 같이 제공하고 있습니다.
- 직접접종법을 통한 무균성 확보
- 무균제품 생균수 시험(평판법)
- 마이코플라즈마 배양분석
- 마이코플라즈마 PCR 검사
- Mycobacterium spp. 검출
Pyros® Kinetix® Flex 기반 내독소 검출
싸토리우스의 전문 연구원이 고객사의 의약품 개발 공정에 정확하게 필요한 미생물 연구 시험 계획을 수립하여 드립니다.
공정에 즉시 도입 가능한, 인증된 품질의 미생물 시험법으로 분석대상물의 검증과 밸리데이션을 신속하게 실시하면 연구일정을 단축할 수 있습니다.
제조공정을 중단하지 않고 compendial 시험과 PCR 시험을 동시에 진행, 제조공정을 보다 빠르게 수행할 수 있습니다.
샘플 | 무균 시험 | 생균수 시험 | 마이코플라즈마 테스트 (Compendial) | 마이코플라즈마 PCR 검사 | 마이코박테리움 검출 시험 | 밀도 시험 |
|---|---|---|---|---|---|---|
연구용 세포은행 | X | - | - | X | X* | - |
마스터 세포은행 | X | - | X | - | X* | - |
제조용 세포은행 | X | - | X | - | X* | - |
생산종료 세포은행 | X | - | X | - | X* | - |
마스터 바이러스 시드 | X | - | X | (X) | X* | - |
제조용 바이러스 시드 | X | - | X | (X) | X* | - |
비정제 배양회수액 | - | X | X | (X) | X* | - |
원료의약품 | X | - | - | - | - | - |
완제의약품 | X | - | - | - | - | X |
X* 마이코박테리움 시험은 인간세포주 / 영장류세포주, 또는 이들 세포주에서 유래한 제품에 대하여만 실시 필요.
(X) 샘플 바이러스 중성화가 불가한 경우 여타의 위험 기반 시험법 적용 가능. 단, 규제기관 협의 필요.
무균 시험 무균 시험은 바이오 의약품과 바이러스 백신의 제조 공정 상 필수적으로 실시하여야 하는 공정입니다.
싸토리우스의 무균시험 서비스는 GMP는 물론 유럽약전(EP), 일본약전(JP), 미국약전(USP) 기준을 충족하며, 직접접종법과 멤브레인필터법을 모두 지원하여 제공되고 있습니다.
실험 전, 저농도의 표준물질을 시료에 스파이킹한 후 그 증식여부를 판단함으로써 억제효과를 평가, 샘플 매트릭스의 품질을 확보하고 있습니다.
상기와 같은 스파이킹 실험은 다음과 같은 표준 유기체에 대하여 실시하고 있습니다.
호기성균
- Staphylococcus aureus
- Bacillus subtilis
- Pseudomonas aeruginosa
혐기성균
- Clostridium sporogenes
Fungi
- Candida albicans
- Aspergillus brasiliensis
직접접종법에 의한 무균시험 시에는 샘플을 티오글리콜산액체배지, 그리고 대두카제인소화액체배지(TSB)의 서로 다른 두 증식배지에 바로 접종을 실시하는 반면, 멤브레인필터법에 의한 무균시험시에는 티오글리콜산액체배지와 대두카제인소화액체배지에 접종하기 전에 0.45µM 필터로 먼저 여과를 실시합니다. 양 방법 모두 배양기간은 14일이며, 결과 분석서는 마지막 관찰일로부터 5일 이내에 제출하여 드립니다.
상기와 같은 무균 시험은 완벽하게 무균상태가 확보되어야 하는 검체에 대하여만 실시하는 것으로, 무균상태 확보가 불필요한 검체에 대하여는 미생물부하 시험을 제공하고 있습니다.
이와 같은 시험을 실시하는데 있어 검체 별로 어떤 시험이 적합한지에서부터, 시험에 얼마나 많은 숫자의 샘플이 필요한지, 또 샘플 당 볼륨은 어느 정도로 하여야 하는지에 대하여는 싸토리우스에서 제안해 드리도록 하겠습니다.
미생물 부하 시험은 호기성 조건에서 중온균과 진균이 얼마나 많이 증식하는지를 정량적으로 파악함으로써, 검체 자체 또는 제조공정 상 미생물오염을 방지하기 위한 규칙을 준수하였는지 여부를 식별해 내는데 그 목적이 있습니다. 일견 무균 시험과 유사하나, 중간검체로써 검체의 무균성이 확보될 필요가 없다는 것이 무균 시험과의 대표적인 차이가 되겠습니다. 배양회수액과 같이 공정 진행 중에 채취한 검체를 가지고 실시하는 특성 상, 고객사에서 내부 공정에 맞는 미생물 부하 한계치를 정하게 되면 그 한계치를 초과하지 않음을 입증해 내는 방식으로 실험을 실시합니다. (무균성이 요구되는 배양회수액 샘플에 대하여도 직접 무균 시험을 실시할 수 있습니다 단, 배양회수액 샘플의 경우 미생물 부하 시험과 무균 시험 중 어떠한 시험을 실시할 지는 연구자의 재량에 따릅니다.)
미생물 부하 시험에는 평판법과 멤브레인필터법의 두 가지 시험법이 있습니다. 양 시험법 모두 규제기관에서 인증하는 시험법으로, 연구자 편의에 따라 선택적으로 사용하면 됩니다. 다만, 상대적으로 대량의 샘플을 사용할 때에는 평판법이, 항생제 등에서 특정한 억제효과가 관찰되는 경우에는 멤브레인필터법이 유리합니다.
평판법의 경우에는 검체를 완충수로 10배 희석한 후, 각각 2개 씩 준비된 TSA 배지 / SDA 배지에 정해진 용량으로 분주한 후, 배지의 배양이 완료된 후에 mL당 평균 CFU값(CFU/mL)을 측정합니다.
각 검체 별로 대하여 어떠한 시험법이 적합한지에 대해서는 싸토리우스에서 제안해 드리도록 하겠습니다.
임상시험용이든 시판용이든 의약품의 제조에 있어 마이코플라즈마를 검출, 제거하는 것은 핵심 공정으로 꼽힙니다. 미생물군 자체가 워낙 다양하고 증식도 까다롭기 때문에 시험 공정 자체는 다소 복잡한 측면이 있지만, cGMP, ICH 기준과 유럽약전(EP), 미국약전(USP) 가이드라인을 준수하는 싸토리우스의 마이코플라즈마 검출 서비스를 활용하여 마이코플라즈마 검출 관련 공정을 손쉽게 수행할 수 있습니다.
유럽약전(EP)상 전통적인 마이코플라즈마 테스트법으로는 한천 / 액체배지법과 지표세포 체외배양법이 있으며, 싸토리우스에서는 실험 전, 저농도의 표준물질을 검체에 스파이킹한 후 그 검출여부를 확인, 샘플 매트릭스의 품질을 확보하고 있습니다.
상기와 같은 스파이킹 실험은 다음과 같은 표준 유기체에 대하여 실시하고 있습니다.
- A. laidlawii
- M. gallisepticum
- M. fermentans
- M. hyorhinis
- M. orale
- M. pneumoniae
한천, 액체배지법완충액, 배지
한천, 액체배지법의 경우 샘플을 한천배지와 액체배지에 각각 접종한 후, 혐기/호기의 각각 상이한 환경에서 배양시키는 배양법입니다. 이 과정에서 액체배지에서 배양 중인 배지를 한천배지로 옮겨 접종하게 되며, 미생물 군집이 관찰되면 양성으로 판정합니다. 한천 / 액체배지법에는 총 28일이 소요됩니다.
지표세포 체외 배양법
지표세포 체외 배양법은 적절한 세포기질 (Mouse 3T3 또는 Vero 세포)에 샘플을 접종하여 배양한 후, DNA와 결합하는 형광염색제로 염색합니다. 이렇게 염색된 물질을 광학현미경으로 관찰하면 지표세포의 핵 주변으로 염색된 부분, 즉 마이코플라즈마를 확인할 수 있습니다. 지표세포 체외 배양법의 경우, 결과 분석서를 마지막 관찰일로부터 5일 이내로 신속하게 제출하고 있습니다.
마이코플라즈마 신속 PCR 검출법
최근 유럽약전(EP)에서도 마이코플라즈마 검출 시 한천 / 액체배지법 이외에도 마이코플라즈마 신속 PCR 검출법을 적용할 수 있게 되었습니다. 미 FDA의 경우에는 지난 2012년 부터 바이오의약품 출시 시, PCR 기반의 마이코플라즈마 검출법을 허용하여 옴에 따라 최대 28일까지도 소요되던 기존 마이코플라즈마 검출법의 대안으로 신속 PCR 검출법을 적용할 수 있게 되었습니다. 싸토리우스에서도 마이코플라즈마 신속 PCR 검출법 대행 서비스를 제공하며, 고객으로부터 샘플을 수취한 시점으로부터 최대 48시간 이내에 마이코플라즈마 검출 결과값을 제출하고 있습니다.
마이코박테리움 검출 시험은 마이코박테리움(Mycobacterium spp.)에 특히 취약한 인간 또는 영장류 세포주를 대상으로 시행하는 시험입니다. 먼저, 샘플을 두 종류의 한천 선택배지와 한 종류의 액체 배지에 접종한 후, 모든 배지를 36 ~ 38℃에서 56일 간 배양하여 마이코박테리움 검출 여부를 확인합니다.
특히, 이 시험에서는 검체에 양성대조 마이코박테리아 결핵균주를 스파이킹하여 마이코박테리움 증식이 억제되는지 여부를 확인하기 위해 반드시 스파이크 대조군을 유지하여야 합니다.
또한, 모든 마이코플라즈마 신속 PCR 검출법은 유럽약전(EP) Section 2.6.2.를 준수하여 실시되어야 합니다.
엔도톡신 시험은 통상적으로 완제의약품에 대하여만 실시하면 되며, 엔도톡신, 즉 내독소는 그람음성 박테리아 세포벽 피막의 일부로, 바이오의약품의 개발공정 중 또는 완제의약품 완성 시에 배양된 세포를 오염시킬 수 있는 주요 오염원 중 하나입니다.
엔도톡신 시험은 투구게의 혈액세포에서 뽑아내는 수용성 추출액인 ‘투구게 아메바 세포 용해질’ (LAL)을 액체 샘플이나 표준 내독소 희석액에 첨가하여 탁도를 확인하는 비탁시험(turbidimetric test)을 수행하는 방식으로 이루어집니다. 내독소의 농도가 높은 경우에는 혈전효소가 활성화되는 속도가 빠르기 때문에 탁도값이 높게 도출됩니다. 비탁시험은 역학분석법이므로, 탁도값을 도출하는데 있어 특정한 광학밀도(OD)에 도달하는 시간이 핵심적인 지표가 됩니다.
싸토리우스의 Pyros® Kinetix® Flex 및 Pyros® eXpress 소프트웨어는 비탁시험을 높은 신뢰성으로 수행할 수 있도록 밸리데이션 된 솔루션으로, 검체의 onset time을 표준곡선과 대비함으로써 검체 내 내독소의 농도를 정량적으로 확인할 수 있습니다.
싸토리우스의 모든 역학적 엔도톡신 분석은 미국약전(USP) (<85> Bacterial Endotoxins)과 유럽약전(EP) (2.6.14 Bacterial Endotoxins)의 유관규정을 준수하여 수행되고 있습니다.
이들 유관규정에 따라, 한 샘플 매트릭스에 대한 억제 / 증진 효과를 반드시 확인한 연후에 다음 샘플 매트릭스에 대한 시험을 실시하고 있습니다.
