면역세포 기능을 위한 T세포 기억
최초 감염 시 우리 몸의 적응면역체계는 적절한 작동 T세포를 식별하고, 면역에 대한 특정 위협과 맞서 싸우기에 최적화된 다양한 기능을 가질 수 있도록 세포를 확장 및 전환시킵니다. 감염 제거에 성공하면 대부분의 적응 T세포는 세포자멸사를 거치고, 비균질적인 기억 T세포를 남깁니다. 이 세포들은 항원 특이적 T세포로, 감염 제거 후에도 오랫동안 남습니다. 인체가 같은 항원에 다시 노출되면 기억 T세포는 빠르게 대량의 작동세포로 바뀌어 이미 본 적 있는 감염에 신속하게 대응합니다.
백신과 입양세포 전환 면역치료 프로토콜은 모두 기억 T세포의 비균질성에 영향을 받기 때문에 하나의 방법으로 이처럼 다양한 기능을 가진 기억 T세포의 하위 군집을 식별할 수 있어야 합니다. 기존의 기억 T세포 표현형 및 사이토카인 분비 측정 기술에는 흔히 다음과 같은 단점이 있습니다.
- 사이토카인(ELISA 등), 표지자 발현(기존 유세포분석 등)에 대해 별도의 분석법이 필요합니다.
- 장비의 획득 처리량이 낮고, 대량의 샘플이 필요합니다.
- 여러 출처에서 수집한 데이터를 직접 분석하고 취합해야 합니다.
- 프로토콜 최적화, 고정, 반복적인 세척 등 필요한 단계가 많아 시간이 오래 걸립니다.
iQue® 인간 T세포 기억 솔루션은 iQue® 인간 T세포 기억 키트를 사용해 높은 처리량으로 기억 T세포의 표현형과 분비되는 작동 단백질 및 사이토카인을 동시 분석합니다. iQue® 고성능 고처리량 유세포분석과 통합 iQue Forecyt® 소프트웨어의 실시간 데이터 분석 기능을 활용해 면역항암제 개발 및 연구에 적용할 수 있는 간편한 기억 T세포 군집 정량화 솔루션을 경험해 보시기 바랍니다.
분석 개요
그림 1. iQue® 인간 T세포 기억 키트 분석 원리
기본 T세포 표현형은 CD3, CD4, CD8 표지자 염색을 통해 측정합니다. 활성화 후 분화 단계에 따른 T세포 하위 군집(TN, TSCM, TCM, TTM, TEM, TEMRA, TTE)은 CD45RA, CD45RO, CD27, CD62L, CD95 표지자 염색을 통해 측정합니다. 전염증성 사이토카인 IFNγ와 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비 역시 같은 분석 웰에서 샌드위치 면역분석 포맷으로 Qbeads를 사용해 정량화합니다. 살아 있는 면역세포는 형광 세포막 완전성 염료를 사용해 죽은 세포와 구별합니다.
주요 장점
- 생물학적 인사이트 확보 - 생리학적으로 관련성 높은 모델로 T세포 기억 표현형 연구
- 생산성 향상 - 혼합된 세포와 비드 분석 포맷을 사용해 세포 표지자 발현과 사이토카인 분비 동시 측정
- 데이터 분석 간소화 - 실시간 데이터 분석 및 새로운 시각화 툴로 정량적 분석 결과를 신속하게 생성
- 시간 및 샘플 절약 - 기존의 복잡한 분석과정을 하나로 줄인 간단한 Multiplex 분석법
생물학적 인사이트 확보
그림 2. 사이토카인 자극을 통해 자가재생 능력이 높은 기억세포를 5일간 유지
PBMC(100K/웰)를 ‘핵심’ 사이토카인(IL-4, 100ng/mL 및 IL-7, 10ng/mL) 및 Dynabeads CD3/CD28(25K/웰)과 함께 단독 배양으로 시딩했습니다. 세포는 여러 사이토카인(IL-15, 10ng/mL 및 IL-6, IL-21, IFNß, 100ng/mL)을 조합해 처리했고, 2일 차와 5일 차에 10µL의 샘플을 채취해 iQue 인간 T세포 기억 키트로 분석했습니다.
IFNß(빗금 막대)를 포함시키는 경우 IL-10 생성이 증가했고, CD8에 양성인 중심기억 T세포의 비율도 3배로 늘었습니다. 다른 인터루킨(예: IL-6)과 조합한 경우 IL-10 생성이나 TCM 군집이 증가하지는 않았습니다.
표시된 데이터는 입양세포 치료제 바이오 제조에 맞춰 배양 조건을 최적화할 수 있도록 설계된 대규모 패널 분석을 통해 확보한 것입니다. 히트 맵은 테스트한 모든 처리 방식의 TCM 세포를 나타냅니다. 청록색 상자로 표시한 것은 IFNß로 처리한 경우로, 다른 처리 방식과 비교해 TCM 세포의 비율이 높았습니다.
그림 3. T세포 내 CAR 발현을 유도하는 경우 자가재생 능력이 높은 기억 세포가 항상 유지되지는 않음
HER-2 및 CD19 CAR-T를 해동했습니다. 동일한 공여자로부터 채취한 대조군 T세포를 3일 동안 Dynabead CD3/CD28로 활성화했습니다. 세포를 T세포 기억 항체 패널로 라벨링하고(100K/웰, 반복실험 5회) 표현형을 분석했습니다. (A)는 T세포가 서로 다른 기억 표현형으로 발달하는 과정에서 나타나는 표면 표지자 발현 변화를 보여줍니다. T세포는 미성숙 T세포(TN) > 줄기세포 기억 T세포(TSCM) > 중심기억 T세포(TCM) > 전환기억 T세포(TTM) > 작동기억 T세포(TEM) > 종착 작동 T세포(TTE)를 거쳐 세포사에 이르게 됩니다. (B)는 활성화된 T세포, (C)는 HER-2 CAR-T, (D)는 CD19 CAR-T 기억 표현형을 나타냅니다.
생산성 향상
그림 4. 공여자 간 T세포 기억 발달 차이
3명의 공여자로부터 분리한 PBMC(120K/웰)를 Ramos 세포와 혼합배양(E:T = 3:1)하고, Dynabead CD3/CD28의 수를 늘려 가며 활성화했습니다. 72시간 후, iQue® 인간 T세포 기억 키트를 사용해 10µL의 샘플을 분석했습니다.
(A) 공여자 1, (B) 공여자 2, (C) 공여자 3 그래프는 T세포 기억 발달 과정의 각 단계에서 단백질을 발현하는 CD3 양성 세포의 비율을 보여줍니다 IL-10 분비도 확인할 수 있습니다. 청록색 막대는 활성제가 포함되지 않은 대조군입니다. 회색 막대는 웰당 비드 60K개, 120K개, 480K개의 Dynabead 농도 3단계를 낮은 것(밝은 회색)부터 높은 것(어두운 회색) 순서로 나타낸 것입니다.
데이터 분석 간소화
그림 5. iQue Forecyt®의 사전 정의된 게이트로 탈진 T세포 하위 군집 자동 표현형 분석
3명의 공여자로부터 채취한 PBMC(120K/웰)를 다양한 밀도의 Dynabead CD3/CD28로 활성화했습니다. 분석은 3일 차에 iQue® 인간 T세포 기억 키트로 수행했습니다. (A)의 그래프는 기억 T세포 군집 중 중심기억 T세포(TCM)와 전환기억 T세포(TTM), 작동기억 T세포(TEM)를 분리하는 데 사용된 게이팅 전략을 보여줍니다. (B)의 히트 맵은 각 공여자의 T세포 가운데 TEM 표현형을 나타내는 세포의 비율을 보여줍니다. 공여자 2는 다른 두 공여자와 비교하여 낮은 밀도의 Dynabead에도 높은 민감도로 TEM 표현형 형성을 나타냈습니다. (C)는 (B)의 데이터를 농도반응곡선으로 요약한 것입니다.
시간 및 샘플 절약
그림 6. iQue® 인간 T세포 기억 키트를 사용한 쉬운 T세포 표현형 및 사이토카인 분비 분석 프로토콜
혼합 세포와 비드 기반 분석을 사용해 하나의 웰에서 세포 표지자 발현 데이터와 상층액 사이토카인 농도를 획득합니다. 별도의 최적화나 희석 과정이 필요 없고, 세척이 한 번만 필요해 빠른 시간 안에 결과를 얻을 수 있는 간소화된 분석과정입니다.
자주 묻는 질문
iQue® 인간 T세포 기억 키트에는 IFNγ와 IL-10을 모두 검출할 수 있는 iQue QBeads®가 함께 제공되지만, 사이토카인이 상층액으로 분비되는 경우에만 측정할 수 있습니다.
이 분석법은 최소 시딩 밀도 1 x 106개/mL를 기준으로 검증되었습니다. 따라서 분석 시작 시 해당 밀도를 권장합니다. 세포 이벤트/하위 군집이 드문 경우, 이 기준에 맞춰 세포 수를 늘려야 통계적으로 관련성 있는 데이터를 확보할 수 있습니다. 첨가하는 세포 수에 따라 사이토카인 수준의 검출 가능 여부도 확인해야 합니다. 검량선의 선형 구간을 기준으로 사이토카인 수준이 너무 높아 측정할 수 없으면 샘플 희석이 필요할 수 있습니다.
iQue® 인간 T세포 기억 키트를 사용하면 하나의 분석 플레이트로 시간에 따라 여러 번의 측정을 수행할 수 있습니다. 극소량(10µL)의 세포 및 상층액 샘플로도 T세포 기억 키트를 사용해 분석을 수행할 수 있기 때문에 각 샘플을 후드에서 무균 상태로 취한 뒤 분석 플레이트를 배양기로 되돌려놓고, 시간이 지난 뒤 다음 샘플을 분석하면 됩니다. 샘플을 취하기 전에는 고른 샘플링을 위해 내용물을 잘 정제하는 것이 권장되지만, 이 과정은 세포에 영향을 미치지 않으며 여전히 적은 양의 샘플로도 분석을 수행할 수 있습니다.
주문 정보
인간 T세포 기억 키트 | ||
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플랫폼: iQue3/iQue Screener PLUS VBR configuration과 호환 | ||
| 크기 | 카탈로그 번호 | |
1 x 96웰 | 97035 | |
5 x 96웰 | 97036 | |
1 x 384웰 | 97037 | |
5 x 384웰 | 97038 | |
