키나아제 Akt 분석 개요

Incucyte^® 키나아제 Akt 렌티바이러스 시약을 사용해 다양한 종류의 세포에서 안정적이고 유전적으로 암호화된 키나아제 작용 리포터를 발현시켜 시간에 따른 생세포의 Akt 키나아제 작용을 모니터링합니다. 

그림 1. 생세포의 Akt 작용에 대한 화합물의 영향 측정 - 안정적으로 Incucyte^® 키나아제 Akt Green/Red 지표를 발현하는 SK-OV-3 세포를 선택적 Akt 억제제 MK2206으로 처리하여 녹색 형광 센서가 세포질에서 핵으로 이동하게 했습니다.  왼쪽의 동역학 그래프를 보면 Akt 억제로 인한 핵의 이동비 감소를 알 수 있습니다.  이미지 패널은 위상과 상단의 적색 형광 이미지 채널, 하단의 녹색 형광 채널을 나타냅니다.  녹색 형광 센서는 28분에 걸쳐 세포질에서 핵으로 이동하지만, 적색 형광 핵 표지자의 위치는 바뀌지 않습니다. 

여러 화합물이나 치료제를 96웰 포맷으로 분석해 생산성을 높입니다.  타깃 중심의 단일 생화학적 분석과 처리량이 낮은 세포 기반 후속 실험 사이의 공백을 메워 새로운 치료제의 식별을 도와줍니다.   

그림 2. 생세포의 동역학적 데이터를 사용해 여러 화합물의 Akt 작용에 대한 시간별 영향을 96웰 플레이트로 분석 - 안정적으로 Incucyte^® 키나아제 Akt Green/Red 지표를 발현하는 A549 세포를 96웰 플레이트에 시딩했습니다(5K/웰).  그 다음, 알로스테리 Akt 억제제 MK2206 및 API-1, 경쟁 Akt 억제제 AZD5363 및 Ipatasertib, 업스트림 PI3K 키나아제 억제제 LY294002 및 PI-103을 비롯해 PI3K/Akt 키나아제 경로를 표적으로 하는 억제제로 세포를 처리했습니다.  96웰 마이크로플레이트 그래프(왼쪽)를 보면 테스트한 모든 화합물에 대해 Akt 억제로 인하여 시간과 농도에 따라 핵 이동비(NTR)가 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 24시간에 걸친 AZD5363 및 LY294002의 NTR 동역학 그래프(중앙)는 다양한 동역학 프로파일을 보여줍니다.  AZD5363을 첨가하자 24시간에 걸쳐 Akt가 지속적으로 억제되었고, PI3K 억제제 LY294002를 첨가한 경우 NTR이 일시적으로 감소했다가 Akt 재활성화로 인해 다시 기준치로 회복되었습니다.  IC50 곡선(오른쪽)은 1시간 30분 및 24시간 이후의 시점 데이터를 나타낸 것입니다. 

생세포를 사용해 시간에 따른 Akt 작용의 단기적, 장기적인 동적 변화를 높은 민감도로 연속 검출해 새로운 인사이트를 확보할 수 있습니다. 자동으로 Akt 억제를 측정 및 시각화하고, 어느 시점에서든 동역학적 측정을 수행합니다.  

그림 3. 시간에 따른 혈청기아와 Akt 활성화의 영향 관찰 - 안정적으로 Incucyte^® 키나아제 Akt Green/Red 지표를 발현하는 HeLa 세포를 혈청이 없는 배지로 옮겨 PI3K/Akt 키나아제 경로를 활성화하는 것으로 알려진 다양한 성장인자를 제거했습니다.  혈청이 바뀌자 Akt 작용 감소로 인해 핵 이동비(NTR)가 감소했지만, 10% 혈청을 사용한 대조군 웰에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았습니다.  4시간 후 세포를 1.1ng/mL의 표피성장인자(EGF) 또는 3.3nM의 R3-IGF-1(인슐린과 유사한 성장인자의 재조합 유사물질)로 처리했습니다.  두 화합물 모두 Akt의 활성화를 유도했음을 NTR의 급격한 증가를 통해 알 수 있습니다.  R3-IGF-1을 첨가한 경우 12시간에 걸쳐 활성화가 지속되었지만, EGF에 의한 활성화는 시간에 따라 감소했습니다. 왼쪽에서 모든 조건의 대표 이미지를 볼 수 있습니다.  화합물을 첨가하기 전까지 센서는 무혈청 배지의 경우 세포 핵에, 대조군인 10% 혈청 배지의 경우 세포질에 위치합니다(3h 이미지 참조).  EGF 또는 R3-IGF-1로 활성화하면 센서의 위치는 핵에서 세포질로 이동합니다(4.5 h 이미지 참조).   EGF로 처리한 세포에서는 Akt 작용이 시간에 따라 감소하면 센서도 핵으로 돌아가지만, R3-IGF-1로 처리한 세포의 센서는 그대로 세포질에 남습니다(12 h 이미지 참조). 

Akt 키나아제 작용과 확산을 하나의 분석으로 정량화합니다. 하나의 세포 군집을 사용해 Akt 억제가 암세포 확산에 미치는 영향에 대한 인사이트를 확보합니다. 

그림 4. Akt 작용과 세포 확산을 하나의 분석으로 동시 측정 - 안정적으로 Incucyte^® 키나아제 Akt Green/Red 지표를 발현하는 MDA-MB-231과 T-47D 세포를 96웰 플레이트에 시딩했습니다(각각 2.5K/웰 및 4K/웰). 선택적 Akt 억제제(MK2206)와 단백질 합성 억제제(사이클로헥시미드)로 처리한 뒤 Akt 작용을 나타내는 핵 이동비(NTR)와 세포 확산을 나타내는 적색 오브젝트 수를 같은 세포로 동시 모니터링했습니다. NTR의 동역학 그래프(상단)는 두 세포주에서 모두 MK2206에 의해 농도에 따른 Akt 억제 작용이 나타났음을 보여줍니다. 같은 세포로 측정한 적색 오브젝트 수(중앙)를 보면 MK2206에 의한 두 세포주의 Akt 억제 효과에 차이가 있음을 알 수 있습니다. T-47D 세포의 경우 농도에 따라 억제 효과가 달라졌지만, MDA-MB-231 세포에서는 농도가 거의 영향을 미치지 않았습니다. 사이클로헥시미드로 처리한 경우 두 세포주 모두 Akt 작용에 대한 영향 없이 세포 확산만 억제되었습니다.  적색 오브젝트 수(24 h)와 핵 이동비(72 h)에 대한 IC₅₀ 그래프도 확인할 수 있습니다(하단).  NTR을 이용해 측정한 Akt 억제 IC₅₀는 두 종류의 세포에서 비슷하게 나타났지만, 적색 오브젝트 수의 IC50은 MDA-MB-231 세포보다 T-47D 세포에서 훨씬 왼쪽으로 치우쳤습니다.