T세포 특성분석

그림 2. 작용기전에 따라 달라지는 T세포 반응.  PBMC(120K/웰)를 Nuclight Green으로 라벨링한 Ramos 세포(40K/웰)와 함께 혼합배양했습니다. 활성화는 CD3/CD28 Dynabeads, CD3xCD19 BiTE 항체, 또는 포도상구균장독소 B(SEB)로 유도했습니다. 60시간 후, T세포 활성화 키트, T세포 매개 살해 키트, T세포 탈진 키트와 iQue3 시스템으로 10µL의 샘플을 분석했습니다.

그 결과, 활성제에 따라 다음과 같이 서로 다른 CD3 양성 T세포 단백질 발현 및 살해 프로파일을 얻을 수 있었습니다.

• CD3/CD28 Dynabeads: 농도에 따라 T세포 활성화가 나타났습니다. 비드 수가 가장 클 때 활성화 표지자 발현율도 가장 높았습니다. 탈진 표지자도 높게 나타나 상관관계를 보여주었습니다.
• CD3xCD19 BiTE 항체: 타깃 세포의 세포사가 가장 크게 증가했고, 활성화와 탈진 수준은 Dynabeads 및 SEB와 비교해 훨씬 낮았습니다. BiTE 매개 면역세포 살해는 장기간 지속 가능한 것으로 보입니다.
• SEB: 농도가 가장 낮을 때에도 T세포 활성화와 살해가 높게 나타났고, 이로 인해 탈진 수준도 높았습니다.

그림 3. T세포 사이토카인 분비에 직접적인 영향을 미치는 작용기전.Nuclight green으로 라벨링한 Ramos 및 PBMC(3:1 비율)가 포함된 혼합배양 분석을 통해 T세포 활성화 키트, T세포 매개 살해 키트, T세포 탈진 키트를 사용하여 사이토카인 분비를 측정했습니다. IFNɣ 및 TNFa

농도는 여러 키트로 측정한 뒤 모든 키트의 결과값을 바탕으로 평균을 계산했습니다.

각 활성제가 사이토카인 분비에 미치는 영향은 표면 단백질 발현에 대한 영향과 비슷했습니다.

• CD3/CD28 Dynabeads: 사용된 비드 수 전체에 걸쳐 농도에 따라 사이토카인 분비가 증가했습니다.
• CD3xCD19 BiTE: 비드나 SEB와 비교했을 때 사이토카인 생성량이 일관적으로 낮았습니다(그랜자임 B 최대 농도 제외). 독성의 위험(예: 사이토카인 분비 증후군)은 낮추고 살해 효과를 높일 수 있음을 알 수 있습니다.
• SEB: 농도가 낮을 때에도 사이토카인 분비량이 높게 나타났습니다.

* 검출 상한 도달

그림 4. 자극 방식에 따라 영향을 받는 기억 T세포 반응. PBMC(120K/웰) 및 Ramos 세포를 3가지 활성제와 함께 혼합배양했습니다(E:T = 3:1). 60시간 뒤, T세포 기억 키트를 사용해 10µL의 샘플을 분석했습니다.

(A) 서로 다른 T세포 표현형으로 발달하는 과정에서 T세포 표면 표지자의 발현이 변화하는 것을 나타낸 도식입니다. T세포는 미성숙 T세포(T_N) > 줄기세포 기억 T세포(T_SCM) > 중심기억 T세포(T_CM) > 전환기억 T세포(T_TM) > 작동기억 T세포(T_EM) > 종착 작동 T세포(T_TE)를 거쳐 세포사에 이르게 됩니다.

(B), (C), (D) 그래프는 T세포 기억 발달 과정의 각 단계에서 단백질을 발현하는 CD3 양성 세포의 비율을 보여줍니다. IL-10 분비도 확인할 수 있습니다. 청록색 막대는 활성제가 포함되지 않은 대조군입니다. 회색 막대는 각 활성제, 즉 CD3/CD28 Dynabeads(30K, 120K, 480K 비드/웰), CD3xCD19 BiTE(0.12, 1.1, 10ng/mL), SEB(1.2, 11, 100ng/mL)의 농도 3단계를 낮은 것(밝은 회색)부터 높은 것(어두운 회색) 순서로 나타낸 것입니다.

BiTE 항체로 활성화한 샘플은 Dynabead 및 SEB 자극과 비교했을 때 발달 후기 단계(T_EM 및 T_TE)의 T세포 비율이 가장 낮았고, 초기 단계(T_N, T_SCM, T_CM)인 세포는 더 많았습니다. BiTE 항체로 자극하면 그림 3에서 볼 수 있듯 살해를 더 많이 유도할 수 있고, 자가재생 능력을 보유한 기억 T세포의 비율이 높아 항원에 대해 더 강력한 반응이 나타난다는 것을 알 수 있습니다.

그림 5. T세포 특성분석 과정 프로토콜. 
필요에 따라 맞춤 조합으로 세포 및 비드 기반 키트를 사용해 활성화, 살해, 탈진, 기억을 분석할 수 있습니다.

그림 6.  부착 세포주와 혼합배양한 후 T세포 자극 효과 측정. PBMC(25K/웰)를 부착성 AU565 세포(5K/웰)와 함께 혼합배양했습니다. T세포 활성화는 SEB로 유도했습니다. 60시간 후, 타깃 세포와 작동세포를 리프팅한 뒤 T세포 활성화 키트, T세포 매개 살해 키트, T세포 탈진 키트와 iQue3 시스템으로 엔드포인트 분석을 수행했습니다.

SEB 활성화 결과 농도에 따라 타깃 세포 살해가 증가했습니다. 또한, 사용한 SEB 농도와 관계없이 CD3 양성 T세포의 활성화 표지자(CD69, CD25, HLA-DR)와 탈진 표지자(PD-1, LAG-3 and TIM-3) 모두 높은 발현율을 보였습니다.