세포자멸사란?
정상적인 조직 발달과 항상성에 반드시 필요한 과정인 세포자멸사는 세포가 적시에 거치도록 예정된 세포사를 말합니다. 암, 자가면역질환, 신경변성 등 인간에게서 나타나는 다양한 질병은 병리학적으로 세포자멸사 신호의 이상과 관련이 있습니다. 대부분의 경우 세포자멸사 유도는 카스파제 활성화(시스테이닐 아스파르트산염 단백질 분해효소)와 형질막 변형으로 이어집니다. 활성화 시 비가역적인 세포자멸사 결정을 유도하는 카스파제-3이나 카스파제-7은 신뢰성 높은 세포자멸사 표지자로 간주됩니다. 조절에 의해 형질막 포스파티딜세린(PS)의 균형이 파괴되는 것도 일반적인 세포자멸사 표지자입니다. 일반적으로 안쪽을 향하고 있던 PS는 세포가 죽어가는 동안 세포 표면으로 이동합니다. 따라서 세포 주변의 식세포를 통해 대식작용을 조기에 파악할 수 있습니다.
많은 효소 분석, 플레이트 리더 분석, 유세포분석은 카스파제-3/7 활성화나 PS 외부화를 측정할 수 있도록 설계되었습니다. 대부분의 카스파제-3/7 분석은 효소가 인식할 수 있는 DEVD(Asp-Glu-Val-Asp) 펩타이드 모티프를 바탕으로 한 루시페레이스, 비색분석, 형광분석 시약 기질을 사용합니다. PS 잔기에 대해 친화성과 선택성이 높은 재조합 단백질, Annexin V를 사용하면 세포자멸사를 검출할 수 있습니다. 형광 프로브와 접합된 Annexin V를 사용한 세포자멸사 분석법은 PS 외부화 검출에 최적화된 방법으로, 보통 유세포분석을 통해 측정합니다. 이처럼 흔히 사용되는 세포자멸사 분석법의 단점으로는 (1)사용자가 (임의로) 지정한 단일 엔드포인트 측정만 가능하고, (2)여러 번의 세척이나 세포 리프팅 단계가 필요해 사멸 중인 세포나 PS 불균형의 손실을 초래할 수 있고, (3)시간이 지나면 배경 신호가 증가해 장기적 측정에 적합하지 않다는 점이 있습니다.
적용분야
Incucyte® 세포자멸사 분석 소개
Incucyte® 실시간 세포분석 시스템을 사용하면 조직 배양기 내에서 세포자멸사를 실시간으로 자동 분석할 수 있습니다. 혼합 즉시 분석하는 Incucyte® 카스파제-3/7 및 Annexin V 염료로 여러 개의 세포자멸사 경로를 동시에 실시간으로 측정해 보시기 바랍니다. 세포자멸사 신호와 고해상도 Incucyte® 위상대조 이미지 사이의 상관관계를 분석하면 풍부한 생물학적 인사이트를 확보하고 세포자멸사를 형태학적으로 검증(세포 수축, 세포막 수포형성, 핵 농축)할 수 있습니다.
- Incucyte® 카스파제-3/7 염료는 불활성 비형광(DEVD) 기질로, 세포막을 자유롭게 통과한 뒤 활성화된 카스파제-3/7에 부착되어 녹색 또는 적색 DNA 결합 형광표지를 나타냅니다. 자멸한 세포는 형광표지된 핵의 모습을 기준으로 식별할 수 있습니다.
- Incucyte® Annexin V 염료는 매우 밝은 광안정성 CF 염료를 이용한 라벨링으로 자멸한 세포의 노출된 PS와 결합하면 녹색, 적색, 주황색 형광이나 근적외선 신호를 발산합니다.
Incucyte 세포자멸사 분석을 이용한 종양세포, 면역세포, 신경세포 배양액의 세포자멸사를 측정 - Incucyte® Nuclight Green으로 라벨링한 MDA-MB-231 인간 유방 샘암종 세포를 TNFα 및 사이클로헥시미드로 처리(왼쪽)하고, Jurkat T 림프구를 캄프토테신으로 처리(오른쪽)하면 실시간으로 세포자멸사를 검출할 수 있습니다. 자멸한 세포는 혼합 즉시 분석 가능한 Incucyte 카스파제-3/7 Red 염료와 Annexin V Red 염료로 각각 라벨링합니다. 그리고 Incucyte 실시간 세포분석 시스템을 사용해 자멸한 세포를 실시간으로 정량화합니다.
Incucyte® 세포자멸사 분석 개요
- 혼합 즉시 분석하는 Incucyte 카스파제-3/7 및 Annexin V 염료를 배양액에 첨가해 세포자멸사를 실시간 측정합니다.
- Incucyte® 이미지 분석 툴을 사용해 자멸한 세포를 자동 정량화합니다.
- Incucyte® Nuclight 핵 라벨링 시약이나 Incucyte® Cytotox 염료와 결합한 Multiplex 분석으로 세포자멸사와 함께 확산 또는 세포독성을 측정합니다.
주요 장점
Incucyte® 세포자멸사 분석의 주요 장점
- 타임랩스 이미징을 사용한 세포자멸사 시각화 및 정량화 - 직관적인 Incucyte® 이미지 분석 툴을 사용해 시간에 따른 세포자멸사를 관찰하고 자멸한 세포를 정량화합니다. 또한, 이미지와 동영상을 통해 형태 변화를 시각적으로 확인하고 처치 효과를 검증합니다.
- 배양기 내에서 시간에 따른 세포자멸사 과정 자동 분석 - 세포를 안정적인 배양기에서 꺼내지 않고 처치 효과의 발생 현황과 시기를 파악할 수 있어 장기 연구(0일~10일 이상)에 적합합니다.
- 세척, 고정, 리프팅 과정 없이 혼합 즉시 분석하는 96/384웰 간편 프로토콜 - 세포를 플레이팅하고, 원하는 화합물로 처리하고, Incucyte 카스파제-3/7 또는 Incucyte Annexin V 염료를 첨가하기만 하면 Incucyte 실시간 세포분석 시스템으로 동역학적 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 중/고처리량 스크리닝으로 최대 6개의 384웰 플레이트를 한 번에 분석해 보세요.
- 2개의 경로를 통해 세포자멸사 검출과 확인을 모두 수행 - Multiplex 방식의 Incucyte® 카스파제-3/7 및 Annexin V 염료를 사용해 세포사 기전인 세포자멸사를 검증할 수 있습니다.
- 확산 및 세포독성을 Multiplex 측정 - Incucyte 세포자멸사 분석과 함께 Nuclight 시약이나 Cytotox 염료를 사용하면 확산/세포독성을 Multiplex 방식으로 측정할 수 있습니다. 세포독성과 세포증식억제 처치 효과를 쉽게 구별해 보세요.
타임랩스 이미징을 사용한 세포자멸사 시각화 및 정량화
그림 1. Incucyte 세포자멸사 분석법과 이미지 분석 툴을 사용한 원하는 세포의 세포자멸사 정량화 - (상단 1번째 이미지)HT-1080 육종 세포를 캄프토테신(100µM) 및 Incucyte 카스파제-3/7 Green 염료와 함께 분석한 Incucyte 이미지입니다. 카스파제-3/7 형광 녹색 신호와 함께 특유의 세포 수축과 세포막 수포형성이 나타났습니다. (하단 1번째 이미지)Incucyte 이미지 분석 툴을 사용하면 세포자멸 종양세포를 자동 계수할 수 있습니다(분홍색 마스킹). (상단 2번째 이미지)MDA-MB-231 유방 샘암종 세포를 TNFα 및 사이클로헥시미드와 카스파제-3/7 Red 염료로 처리한 Incucyte 이미지입니다. (하단 2번째 이미지)Incucyte 이미지 분석 툴을 사용하면 세포자멸 종양세포를 자동 계수할 수 있습니다(하늘색 마스킹). (상단 3번째 이미지)Jurkat T 림프구를 캄프토테신(1µM) 및 Incucyte® Annexin V Red 염료와 함께 분석한 Incucyte 이미지입니다. (하단 3번째 이미지)자동 이미지 분석 기능으로 세포자멸 면역세포를 직접 검출할 수 있습니다(청색 마스킹). (상단 4번째 이미지) 랫드의 앞뇌 뉴런과 별아교세포의 혼합배양물에 글루탐산염(300µM) 및 Incucyte® Annexin V Green 염료를 첨가해 분석한 Incucyte 이미지입니다. 뉴런은 Incucyte® Neurolight Red 렌티바이러스를 사용해 선택적으로 라벨링했습니다. (하단 4번째 이미지)자멸한 세포를 양성으로 표시한 분석 이미지입니다(청색 마스킹).
배양기 내에서 시간에 따른 세포자멸사 과정 자동 분석
그림 2. 비침습적 방식을 사용해 자동으로 처치 효과 정량화 - Incucyte® 세포자멸사 분석법은 96/384웰 플레이트의 모든 웰을 자동으로 이미징하고 분석해 시간에 따른 마이크로플레이트 세포자멸사 분석 결과를 보여줍니다(왼쪽). 또한, 시간별 데이터를 통해 농도에 따른 처치 효과를 확인하고(중앙) 데이터를 농도반응곡선으로 변환해 약리학적 특성을 비교할 수 있습니다(오른쪽).
세척, 고정, 리프팅 과정 없이 혼합 즉시 분석하는 96/384웰 간편 프로토콜
세포를 플레이팅하고, 원하는 화합물로 처리하고, Incucyte 카스파제-3/7 또는 Incucyte Annexin V 염료를 첨가하기만 하면 Incucyte 실시간 세포분석 시스템으로 동역학적 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 중/고처리량 스크리닝으로 최대 6개의 384웰 플레이트를 한 번에 분석해 보세요.
2개의 경로를 통해 세포자멸사 검출과 확인을 모두 수행
그림 4. 2개의 세포자멸사 분석 경로로 세포자멸사 확인 - 배양물의 카스파제-3/7과 Annexin V 신호를 모두 검출하고, 자동으로 시간에 따른 세포자멸사 과정을 분석합니다.
확산 및 세포독성을 Multiplex 측정
그림 5. 무표지 생세포 계수는 물론, 시간 및 농도에 따른 세포독성 및 확산까지 정량화 가능한 Multiplex 세포자멸사 측정 - 캄프토테신(1µM) 또는 사이클로헥시미드(1µM)로 처리한 HT-1080 섬유육종 세포를 Incucyte® Annexin V Green 염료로 라벨링하고 24시간 뒤 자멸한 세포를 검출했습니다(죽은 세포 마스킹). 분류 그래프의 세포자멸사를 나타내는 녹색 군집(2번째 컬럼), 시간에 따른 그래프(3번째 컬럼), 농도반응곡선(4번째 컬럼)을 통해 세포독성 화합물과 세포증식억제 화합물의 효과 차이를 알 수 있습니다.
자주 묻는 질문
이론적으로는 그렇습니다. 카스파제-3/7과 Annexin V 프로토콜은 다양한 부착성 및 비부착성 세포주를 사용해 최적화되었으므로 암세포와 면역세포, 신경세포를 비롯한 모든 종류의 세포에 사용할 수 있습니다. 다만 일부 세포에서는 카스파제-3 발현이 나타나지 않을 수 있습니다(예: MCF-7 세포). 이러한 세포의 경우 카스파제-3/7 시약이 아닌 Incucyte® Annexin V 시약을 사용한 세포자멸사 측정을 권장합니다.
네. 위에서 제시한 프로토콜과 데이터를 보면 알 수 있듯, Jurkat 인간 T 림프구 등 부유세포로도 세포자멸사를 정량화할 수 있습니다. 부유세포가 시야에서 벗어나지 않게 하려면 플레이트 코팅이 필요할 수 있습니다. 효과적인 것으로 확인된 코팅으로는 폴리-L-오르니틴, 폴리-D-리신, Matrigel™ 등이 있습니다.
네. 형광이 Incucyte® 실시간 세포분석 시스템과 호환되고 Incucyte® 카스파제-3/7 또는 Annexin V 시약에서 방출하는 형광에 교란을 발생시키지 않는다면 문제없습니다.
네. 위에서 제시한 프로토콜과 데이터를 보면 알 수 있듯, 하나의 웰로 두 개의 세포자멸사 표지자(예: 카스파제-3/7 활성화와 포스파티딜세린 외부화)를 함께 정량화할 수 있습니다. 이 방식을 사용할 때에는 Incucyte® Annexin V Red 시약(Cat No. 4641)과 녹색 Incucyte® 카스파제-3/7 시약(Cat No. 4440)을 함께 사용하는 것을 권장합니다.
네. Incucyte® 카스파제-3/7 시약(Cat No. 4440)과 Incucyte® Red Cytotox 시약(Cat No. 4633)을 함께 사용하거나, 적색과 녹색의 Incucyte® Annexin V 시약(Cat No. 4641 및 4642)과 Incucyte® Cytotox 시약(Cat No. 4632 및 4633)을 결합하면 됩니다.
네. Incucyte® Annexin V Red 시약(Cat No. 4641)은 프로피듐 요오드화물과 함께 사용할 수 있습니다. Incucyte® 시스템의 적색 채널을 사용해 프로피듐 요오드화물을 정량화하고, 분광 불혼화(spectral unmixing) 매개변수를 80% Red from Green으로 설정하는 것을 권장합니다(자세한 사항은 형광염료 최적화에 대한 테크니컬 노트를 참조하시기 바랍니다).***
위 데이터는 10배 및 20배 대물렌즈로 생성되었습니다. 10배 대물렌즈는 시야가 넓고, 웰당 필요한 이미지 수가 적습니다. 공간적 해상도를 높이려면 20배 대물렌즈가 권장됩니다.
Incucyte® 세포자멸사 분석은 Incucyte® ZOOM 시스템에서 지원되며 옆면이 투명하거나 검은색이고 바닥이 투명한 96웰 또는 384웰 마이크로플레이트로 수행할 수 있습니다. 위 실험에서는 Corning 96웰 플레이트(Cat # 3904)를 사용했습니다.
아닙니다. Incucyte® Annexin V 시약은 Incucyte® 시스템을 사용한 실시간 세포 이미징에 맞춘 특수 제형으로 제작되었습니다. 따라서 혼합 즉시 분석이 가능합니다. 세척이나 고정은 필요하지 않습니다.
네. Incucyte® Annexin V 시약이나 카스파제-3/7 시약을 Incucyte® 시스템에 사용하는 경우에는 특수한 분석 배지나 버퍼가 필요하지 않습니다. 통합 Incucyte® 이미지 분석 툴을 사용하면 배지, 시약, 시험 물질에서 발생할 수 있는 배경 형광 신호를 최소화할 수 있습니다. 그러나 Annexin V와 외부화된 포스파티딜세린의 결합은 Ca2+에 의해 좌우됩니다. 따라서 분석 배지의 Ca2+ 농도는 1mM 이상이어야 합니다.
Incucyte® 카스파제-3/7 세포자멸사 시약을 사용하는 경우 자멸한 세포를 계수하는 것을 권장합니다. 카스파제-3/7 시약은 자멸한 세포의 핵을 라벨링합니다. 여러 개의 자멸한 세포가 모여 있어도 핵만 따로 라벨링되므로 세포를 구별하기 쉽습니다. 하지만 Incucyte® Annexin V 시약은 세포 표면 전체를 라벨링하기 때문에 이웃한 세포를 구별하기 어려울 수 있습니다. Annexin V 시약을 사용할 때에는 전체 형광 영역을 정량화하는 것을 권장합니다.
네, 세포자멸사 측정 결과를 정규화해 무표지 Incucyte® 세포 밀집도 측정에 사용할 수 있습니다. 일부 화합물의 경우 상당한 세포 파편화를 초래하거나 세포 위상대조를 크게 변화시킬 수 있습니다. 그러나 Incucyte® 위상대조 밀집도 지표를 사용하면 분석 과정 전체에 걸쳐 전체 세포 수를 추정할 수 있는 것으로 나타났습니다.
세포자멸사 분석 종료 시점에 DNA를 포함한 전체 오브젝트 수를 정규화할 수도 있습니다. 이 경우 Vybrant® DyeCycle™ Green Stain(ThermoFisher) 사용을 권장합니다. 염료는 세포자멸사 시약을 포함한 배지를 흡입하거나 세척할 필요 없이 분석 웰에 직접 첨가할 수 있습니다.
주문 정보
주문 정보
Incucyte 카스파제 3/7 및 Annexin V 염료는 Incucyte 실시간 세포분석 시스템과의 사용에 대해 완전한 검증을 거쳤습니다. 또한, 두 염료를 싸토리우스의 Incucyte Nuclight 핵 라벨링 시약과 함께 사용하거나 Incucyte Cytotox 염료와 결합하면 같은 웰에서 세포자멸사뿐 아니라 확산과 세포독성까지 Multiplex 방식으로 측정할 수 있습니다.
제품 | Qty. | Cat. No. |
|---|---|---|
| Incucyte® 카스파제-3/7 Green 세포자멸사 염료 | 1 바이알: 20μL(테스트 100~200회) | 4440 |
| Incucyte® 카스파제-3/7 Red 세포자멸사 염료 | 1 바이알: 20μL(테스트 100~200회) | 4704 |
| Incucyte® 카스파제-3/7 대사 염료 | 1 바이알: 20μL(테스트 100~200회) | 4776 |
| Incucyte® Annexin V Green 염료 | 1 바이알: 테스트 100~200회 | 4642 |
| Incucyte® Annexin V Red 염료 | 1 바이알: 테스트 100~200회 | 4641 |
Incucyte® Annexin V Orange 염료 | 1 바이알: 테스트 100~200회 | 4759 |
Incucyte® Annexin V NIR 염료 | 1 바이알: 테스트 100~200회 | 4768 |
Incucyte® MMP Orange 시약 키트 | 1 키트: | 4775 |
Incucyte® Cytotox Green 염료 | 5 바이알: 5μL(테스트 100회) | 4633 |
Incucyte® Cytotox Red 염료 | 5 바이알: 5μL(테스트 100회) | 4632 |
Incucyte® Cytotox NIR 염료 | 1 바이알: 100μL(테스트 500~1000회) | 4846 |
