면역세포 살해 연구
종양에 맞서 신체를 보호하는 데 있어 환자의 면역체계는 매우 중요한 역할을 수행합니다. 이러한 항암 반응의 핵심은 세포독성 T세포와 자연살해세포를 비롯한 특정 면역세포가 면역세포 살해(ICK) 과정을 통해 악성 세포의 세포사를 유도하는 능력입니다. 따라서 시험관 내 ICK 모델링은 연구에 필수적입니다. 지금까지 기존의 유세포분석과 생화학적 분석 등 여러 기법이 ICK 분석에 사용되어 왔습니다. 하지만 이러한 방식은 다음과 같은 단점을 가지고 있어 세포의 동적 상호작용에 대해 제한적인 인사이트만을 제공합니다.
- 시간이 오래 걸리는 ‘엔드포인트’식 고정과 염색 프로토콜이 필요하며, 시점당 하나의 이미지만 획득할 수 있습니다.
- 여러 번의 세척 단계가 필요하고, 정량을 위해 방사선이나 항체 라벨링을 사용해야 합니다.
- 여러 샘플(분석 웰)에서 수집한 데이터를 직접 연결해서 시간별 데이터를 구축해야 하므로 인공물이 발생할 가능성이 있습니다.
- 환경 통제가 어려워 세포 변화로 인해 원치 않은 잘못된 실험 결과가 도출될 수 있습니다.
Incucyte® 면역세포 살해 분석법을 사용하면 면역세포와 암세포의 동적 상호작용을 쉽게 시각화, 정량화하고 이해할 수 있습니다. 기존의 면역 또는 종양면역학 분석 프로토콜과 함께 세포 건강과 표현형, 하위 군집, 기능을 교란 없이 비침습적으로 분석할 수 있는 플랫폼을 사용해 면역세포, 항체의 기능 및 살해에 대해 새로운 인사이트를 확보해 보시기 바랍니다.
적용분야
Incucyte ® 면역세포 살해 분석
Incucyte 면역세포 살해 분석법을 사용하면 실시간 자동 분석 기능과 비교란성 생세포 시약을 사용해 조직 배양기 내에서 바로 면역세포 매개 종양세포 살해를 Multiplex 방식으로 직접 측정할 수 있습니다. 유연한 Incucyte 분석 플랫폼은 다음과 같은 연구에 적합합니다.
- 세포독성 T세포 살해
- 항체의존 세포 매개 세포독성(ADCC)
- 종양 구상체 모델의 면역세포 살해
Incucyte® 실시간 세포분석 시스템으로 타임랩스 동영상을 만들어 기존의 2D 모델과 복잡한 3D 모델의 종양세포 살해 과정을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.
먼저 항CD3 항체와 IL-2로 활성화한 PBMC의 T세포 하위 군집이 타깃 SK-OV-3 종양세포를 살해하는 것이 보입니다. SK-OV-3 암세포를 Incucyte® Nuclight Red 렌티바이러스로 라벨링해 생존성 있는 종양세포의 수를 시간에 따라 직접 계수할 수 있습니다. Incucyte® 카스파제-3/7 시약을 첨가하면 세포자멸사를 겪고 있는 세포를 동시에 검출할 수 있습니다(녹색 형광).
그 다음, Incucyte® 세포별 분석을 사용해 전체 타깃 세포와 작동세포의 확산 및 타깃의 세포자멸사 지표를 정량화하고 그래프를 작성했습니다. Nuclight Red Ramos 세포는 Incucyte® Annexin V Green 시약과 함께 인간 PBMC와 배양하여 하위 군집 타깃 세포의 확산, 타깃 세포의 세포사, 면역세포의 확산을 정량화했습니다. 마지막으로 면역세포 살해 구상체 모델에서 발생하는 A549 암세포의 면역세포 살해를 관찰하고 정량화했습니다. Nuclight Red A549 구상체는 비활성화 PBMC 및 활성화 PBMC와 함께 배양했습니다.
Incucyte® 면역세포 살해 분석 개요
- 타깃 종양세포를 원하는 면역세포(T세포나 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 등)와 함께 혼합배양합니다.
- 혼합 즉시 분석할 수 있는 Incucyte® 카스파제-3/7 Green 또는 카스파제-3/7 Red 시약이나 Incucyte® Annexin V Red 또는 Green 시약을 배양액에 첨가하여 종양세포사를 직접 실시간 측정합니다.
- 자동 이미지 분석 기능이 제공되어 종양세포사를 선택적으로 정량화할 수 있습니다. 옵션: 타깃 세포를 다양한 Incucyte® Nuclight 라벨링 시약으로 라벨링해 종양세포 계수를 동시에 수행할 수 있습니다. 라벨링이 어려운 세포는 Incucyte® Cytolight Rapid Red 또는 Incucyte® Cytolight Rapid Green 시약으로 식별할 수 있습니다.
- Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 모듈(Cat. No. 9600-0031)로 분석을 수행하면 라벨링한 타깃 세포 군집과 라벨링하지 않은 작동세포 군집의 확산과 사망을 모두 정량화할 수 있습니다. 부착성 타깃 세포의 경우, 소프트웨어를 통해 타깃 세포가 존재할 때 작동세포의 군집을 추적할 수 있습니다.
주요 장점
- 실시간 동적 상호작용 정량화 - 복잡한 혼합배양액을 사용해 면역세포와 암세포 사이의 상호작용을 측정하고 관찰합니다.
- 종양세포의 세포사 및 생존성 분석 - 비교란성 시약과 직관적인 이미지 분석 툴을 사용해 종양세포나 면역세포의 확산과 세포자멸사를 선택적으로 정량화합니다.
- 유연한 분석 포맷으로 면역세포 살해 연구 - 2D나 3D로 다양한 관련 면역세포 및 종양세포 혼합배양 모델을 분석할 수 있습니다.
- 최적화된 프로토콜로 생산성 최대화 - 세척이나 세포 리프팅, 방사성 라벨링이 필요 없는 최적화된 시약과 프로토콜을 사용해 96웰 또는 384웰 플레이트의 면역세포 살해를 분석합니다.
실시간 동적 세포 상호작용 정량화
면역세포와 암세포 사이의 동적 상호작용을 관찰하고 정량화하여 복잡한 혼합배양 모델로 세포 간 상호작용과 면역학적 시냅스를 연구합니다.
그림 1A. Incucyte 면역세포 살해 분석법을 사용해 면역세포/종양세포 상호작용 시각화. (1) 작은 세포독성 T세포와 라벨링된 큰 종양세포 사이의 물리적 접촉(적색) 및 T 림프구 분열. (2) 세포독성 T 림프구의 공격을 받는 종양세포(이른바 ‘죽음의 입맞춤’). (3) 종양세포의 세포질 과립화 직후 발생한 카스파제 3/7 라벨링(녹색), 핵 농축, 세포사. (4) 종양세포 유사분열: 하나의 세포가 두 세포로 분열.
그림 1B. Incucyte® Fabfluor-488을 사용해 혼합배양액 내 면역세포와 종양세포의 상호작용 시각화 및 정량화. Cytolight Red A549 종양세포와 활성화하거나 활성화하지 않은 PBMC를 혼합하고, 전체 림프구 군집 라벨링을 위해 Incucyte® Fabfluor-488-α-CD45 및 Incucyte® Opti-Green을 첨가했습니다. PBMC 첨가 2시간 후 이미지를 보면 CD45 양성 세포(녹색)와 A549 세포(적색) 사이의 상호작용을 확인할 수 있습니다. 상호작용(이미지의 노란색 오버레이 마스크)을 정량화하면 막대 그래프에서 볼 수 있듯 종양세포의 면역세포 살해를 위한 세포 작용으로 인해 활성화된 작동세포와 타깃 세포의 상호작용이 뚜렷하게 증가했음을 볼 수 있습니다. 분석은 Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 모듈로 수행했습니다.
종양세포의 세포사 및 생존성 분석
비교란성 시약과 직관적인 Incucyte® 이미지 분석 툴을 사용해 종양세포의 생존성 및 세포사나 면역세포의 확산을 정량화합니다.
그림 2A. Incucyte® 면역세포 살해 분석을 통해 부착성 종양세포와 작동세포의 확산, 사망, 하위 군집 측정. Incucyte® Nuclight NIR 렌티바이러스로 형질도입된 A549 세포를 서로 다른 수의 활성화되거나(상단) 활성화되지 않은(하단) PBMC와 혼합배양하고, Incucyte® Annexin V Orange 시약, Incucyte® Fabfluor-488-α-CD45 항체 복합체, Incucyte® Opti-Green 배경 억제제를 첨가했습니다. NIR(청색) 핵의 정량화 결과를 보면 타깃 세포의 확산과 주황색 형광 영역(아넥신 V), 타깃 세포의 세포사를 알 수 있습니다. Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 모듈을 사용하면 종양세포가 존재할 때 작동세포의 총 수를 무표지 방식으로 정량화할 수 있습니다. Fabfluor-CD45를 첨가하면 80% 이상이 CD45 양성 면역세포임을 관찰할 수 있습니다.
그림 2B. Incucyte® 세포별 분석 모듈을 사용해 비부착성 타깃 세포와 작동세포의 확산, 사망, 하위 군집 측정. Incucyte® Nuclight Orange 렌티바이러스 시약으로 형질도입된 Ramos 세포를 활성화되거나 활성화되지 않은 PBMC와 혼합배양(CD3/IL2 사용)하고, Incucyte® Annexin V NIR 시약, Incucyte® Fabfluor-488-α-CD8 항체 복합체, Incucyte® Opti-Green 배경 억제제를 첨가했습니다. 주황색(적색) 핵의 정량화 결과를 보면 타깃 세포의 확산과 NIR 형광 영역(청색), 타깃 세포의 세포사를 알 수 있습니다. Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 모듈을 사용하면 타깃 세포의 세포자멸사 지표인 타깃 세포와 작동세포의 시간에 따른 총 수를 정량화하고 그래프로 변환할 수 있습니다.
유연한 분석 포맷으로 면역세포 살해 연구
PBMC, 세포독성 T 림프구, NK 세포를 비롯한 폭넓은 관련 모델을 부착성 또는 부유성 종양세포와 혼합배양하여 분석합니다. T세포 매개 세포 매개 세포독성 및 항체의존 세포 매개 세포독성(ADCC) 포맷으로 원하는 작동세포나 타깃 세포를 사용해 종양 구상체 모델의 면역세포 살해를 시간별로 시각화 및 정량화해 보시기 바랍니다.
그림 3A. ADCC: 트라스투주맙(Herceptin®)으로 유도한 SKOV-3 난소암 세포의 면역세포 살해를 구상체 모델로 재현 - HER2 양성 SKOV-3 Nuclight 구상체(2.5K/웰)를 PBMC(6.25K/웰)와 함께 시딩하고, 헤르셉틴(mAb를 표적으로 하는 HER2 수용체)으로 처리한 뒤 10일에 걸쳐 이미징했습니다(A). 헤르셉틴으로 인한 SKOV-3 구상체 성장의 억제는 형광 강도로 평가했습니다(B).
그림 3B. ADCC: 트라스투주맙(Herceptin)으로 유도한 SKOV-3 난소암 세포의 면역세포 살해 - PBMC를 SKOV-3 Nuclight Red(HER2 양성) 또는 A549 NucLight Red(HER2 음성) 종양세포와 함께 혼합배양했습니다. SKOV-3(A)에서는 트라스투주맙으로 유도한 농도에 따른 종양세포 확산 억제가 시간별로 나타났지만, A549 세포(B)는 그렇지 않았습니다. (C)는 트라스투주맙의 SKOV-3 세포 확산 억제를 보여주는 농도반응곡선입니다. (D)는 항체 첨가 72시간 후 항체가 있거나 없는 경우의 미처리 이미지(상단) 및 마스킹 이미지(하단)입니다.
최적화된 프로토콜로 생산성 최대화
세척, 세포 리프팅, 방사성 라벨 없이 96웰 및 384웰 포맷으로 면역세포 살해를 분석합니다.
그림 4A. 분석과정 간소화 및 인사이트 최대화 - 자동 이미지 및 분석 기능과 실험실 테스트를 거친 프로토콜을 결합해 부착성 및 비부착성 타깃 종양세포를 2D 또는 3D 혼합배양 모델로 분석합니다.
흔히 사용되는 면역세포 살해 분석법
암세포의 면역세포 살해 분석에 흔히 사용되는 방법은 엔드포인트 방식인 경우가 많고, 흔히 세포 리프팅이 필요하며(예: 유세포분석), 종양세포 생존성(예: LDH, GAPDH 분비 분석)이나 면역세포 활성도(ELISpot) 결과를 간접적으로만 측정할 수 있습니다. 또한, 대부분의 분석법은 이미지를 사용하지 않습니다. 아래 표는 흔히 사용되는 실험방식의 기능과 단점을 정리한 것입니다.
Incucyte 면역세포 살해 분석 | 유세포분석 | 51 Cr 분비 분석 | GAPDH/LDH 분비 분석 | DELFIA® TRF 분석 | ELISpot | ADCC 리포터 생물검정(Promega) | |
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| 실시간 세포 시각화 |
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| 통합 분석 |
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| 종양세포사 직접 측정 | |||||||
종양세포 생존성 측정 |
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24시간 이상 장기 살해 분석 | |||||||
유연한 타깃 세포 및 작동세포 선택 |
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ADCC 및 T세포 살해 포맷 |
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혼합 즉시 분석, 노워시 |
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384웰 처리 |
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추가 분석에 세포 사용 가능 | |||||||
뛰어난 민감도 |
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방사선 불필요 |
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항체 라벨링 불필요 |
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암 면역항암요법의 발견 - Incucyte® 관련 게시물
Griffiths, G.M. et al. Loss of ARPC1B impairs cytotoxic T lymphocyte maintenance and cytolytic activity(ARPC1B 손실로 인한 세포독성 T 림프구 유지 및 세포용해 작용 손상). J Clin Invest, 129(12):5600-5614, 2019
- CD8 세포독성 T 림프구(CTL)는 분지 F액틴 네트워크를 빠르게 재구성해 용해유발 과립의 양극성 분비를 유도함으로써 적응면역 반응 과정에서 타깃 세포의 세포사를 초래합니다. 이 연구에서는 Incucyte® 실시간 세포분석 시스템을 사용해 장기간에 걸쳐 IL-2 고갈 후 타깃 세포의 손실을 모니터링했습니다.
Adams, KJ et al. The use of induced pluripotent stem (iPS) cells for the safety testing of enhanced affinity TCR-transduced T cells(친화성 향상 TCR 형질도입 T세포의 안전성 시험을 위한 유도만능줄기세포 사용). Cancer Research, AACR; April 5-9, San Diego, CA, 2014
- 인체의 주요 장기를 나타내는 iPS 배양액 패널에 대한 off-target T세포 작용을 시험했습니다. Incucyte® 시스템을 사용한 결과 카스파제-3/7 의존 세포자멸사를 4일에 걸쳐 실시간으로 직접 시각화할 수 있었습니다.
“51Cr 분비 분석 등 단기적인 살해 분석은 물론, 장기적인 LDH 분비 분석을 사용해도 ImmTACs에 의한 전환(redirected) 살해는 놓치기 쉽다. 따라서 Incucyte™ 기술의 조정과 활용은 최대한 엄격한 조건에서 ImmTAC의 효능과 특이성을 평가하는 데 매우 중요하다.”
Adams, K. Redirected T cell activity by high affinity TCR-Anti-CD3 Bispecific candidate therapeutics(고친화성 TCR-Anti-CD3 이중 특이적 치료제 후보물질에 의한 전환 T세포 작용). PhD Dissertation, Cardiff University (2013)
주문 정보
제품 | Qty. | Cat. No. |
|---|---|---|
Incucyte® 세포별 분석 소프트웨어 모듈 | 1 모듈 | 9600-0031 |
| Incucyte® 카스파제-3/7 Green 시약 | 20 µl | 4440 |
| Incucyte® 카스파제-3/7 Red 시약 | 20 µl | 4704 |
Incucyte® Annexin V Green 시약 | 1 바이알 | 4642 |
Incucyte® Annexin V Red 시약 | 1 바이알 | 4641 |
Incucyte® Annexin V Orange 시약 | 1 바이알 | 4759 |
Incucyte® Annexin V NIR 시약 | 1 바이알 | 4768 |
Incucyte® Nuclight Green 렌티바이러스(bleo) | 0.2 mL | 4626 |
Incucyte® Nuclight Green 렌티바이러스(bleo) | 0.6 mL | 4477 |
Incucyte® Nuclight Red 렌티바이러스(bleo) | 0.2 mL | 4627 |
Incucyte® Nuclight Red 렌티바이러스(bleo) | 0.6 mL | 4478 |
Incucyte® Nuclight Green 렌티바이러스(puro) | 0.2 mL | 4624 |
Incucyte® Nuclight Green 렌티바이러스(puro) | 0.6 mL | 4475 |
Incucyte® Nuclight Red 렌티바이러스(puro) | 0.2 mL | 4625 |
Incucyte® Nuclight Red 렌티바이러스(puro) | 0.6 mL | 4476 |
Incucyte® Nuclight Orange 렌티바이러스(puro) | 0.2 mL | 4771 |
Incucyte® Nuclight NIR 렌티바이러스(puro) | 0.2 mL | 4805 |
Incucyte® Cytolight Rapid Green 시약 | 1 바이알(15 µg) | 4705 |
Incucyte® Cytolight Rapid Red 시약 | 5 바이알 x 50 µg | 4706 |
Incucyte® Cytolight Rapid Orange 염료 | 1 바이알(1 mg) | 4839 |
Incucyte® 마우스 IgG2a Fabfluor-488 항체 라벨링 시약 | 1 바이알(50 µg) | 4743 |
Incucyte® 마우스 IgG2b Fabfluor-488 항체 라벨링 시약 | 1 바이알(50 µg) | 4744 |
Incucyte® 마우스 IgG1 FabFluor-488 항체 라벨링 시약 | 1 바이알(50 µg) | 4745 |
